Al comienzo de la Guerra Civil, Trimble participó en los esfuerzos por restringir el movimiento de las tropas de la Unión hacia Washington, D.C., quemando puentes al norte de Baltimore. Cuando se dio cuenta de que Maryland no se separaría de la Unión, regresó a Virginia y se unió al ejército provisional del estado de Virginia como coronel de ingenieros en mayo de 1861. Fue nombrado general de brigada del ejército de los Estados Confederados el 9 de agosto de 1861 y se le asignó la construcción de baterías de artillería a lo largo del río Potomac y, posteriormente, las defensas de Norfolk, Virginia "Norfolk (Virginia)"). Se le dio el mando en el Ejército del Potomac "Ejército del Potomac (confederado)") (el predecesor del Ejército del Norte de Virginia), de una brigada que consistía en regimientos de cuatro estados diferentes, fusionándolos efectivamente en una sola unidad de combate.[3].
Trimble entró por primera vez en combate como parte de la campaña de Thomas J. "Stonewall" Jackson en la primavera de 1862 en el valle de Shenandoah. Se distinguió en la batalla de Cross Keys") al rechazar un ataque de las tropas de la Unión bajo el mando del mayor general John C. Frémont, y luego aprovechar la iniciativa para contraatacar y derrotarlas. Durante las batallas de los Siete Días bajo el mando de Jackson en las afueras de Richmond, Virginia "Richmond (Virginia)"), su brigada tuvo pocos enfrentamientos, pero luchó con fuerza en Gaines' Mill y trató de seguir el infructuoso asalto confederado a Malvern Hill con un ataque nocturno, pero su petición fue rechazada.[4].
En la Campaña del Norte de Virginia, la brigada de Trimble tuvo una buena actuación en la batalla de Cedar Mountain y derrotó a una brigada de la Unión en Freeman's Ford a mediados de agosto. La brigada marchó con Jackson alrededor de la fuerza principal del mayor general John Pope y Trimble desempeñó un papel importante en la batalla de las operaciones de Manassas Station, tomando un depósito de suministros crítico en la retaguardia de Pope. La marcha forzada y la acción de Trimble en Manassas Station recibieron los elogios de Jackson, quien dijo que era "la más brillante que ha llegado a mis manos durante la presente guerra". Pope se vio obligado por esta maniobra a atacar las fuertes posiciones defensivas de Jackson y sufrió una severa derrota en la Segunda Batalla de Bull Run. Trimble fue herido en la pierna durante la batalla el 29 de agosto, resultando en una lesión tan grave que se especuló que fue alcanzado por una bala explosiva.[5].
Aunque Trimble evitó la amputación de su pierna herida, su rehabilitación avanzó lentamente. Durante los meses siguientes, los médicos encontraron periódicamente fragmentos de hueso que debían ser extraídos. En noviembre, desarrolló una erisipela de campo y un probable caso de osteomielitis, y sus ambiciones de ascender al mando de la división quedaron en suspenso hasta que estuviera lo suficientemente bien como para volver al servicio activo. Dejó muy claro a sus colegas su deseo de ascender, y en una ocasión, antes de que el ejército se trasladara al norte, a Manassas "Manassas (Virginia)"), se le citó diciendo (probablemente con humor): "¡General Jackson, antes de que termine esta guerra, tengo la intención de ser un general de división o un cadáver!".[6] Jackson le escribió una carta de recomendación contundente, aunque la matizó incluyendo la frase "No lo considero un buen disciplinador". Trimble emprendió una campaña de envío de cartas desde su cama de enfermo para obtener su ascenso y desafiar la afirmación de Jackson. Escribió al ayudante general Samuel Cooper: "Si voy a tener un ascenso, lo quiero de inmediato y pido especialmente que mi fecha sea a partir del 26 de agosto, la fecha de la captura de Manassas". (Durante este periodo, Trimble también discutió con el general de división J.E.B. Stuart sobre sus informes contradictorios de la batalla y sobre quién era el principal responsable de la toma del depósito de suministros de la Unión).[7].
Trimble fue finalmente ascendido a general de división el 17 de enero de 1863, y se le asignó el mando de la antigua división de Jackson, pero siguió sin poder mandar en el campo de batalla debido a su salud. En la batalla de Chancellorsville, el general de brigada Raleigh E. Colston"), como general de brigada de mayor rango, comandó la división de Trimble. Una reaparición de la enfermedad le obligó a ceder el mando de su división en el Segundo Cuerpo al general de división Edward "Allegheny" Johnson y fue asignado a tareas ligeras como comandante del Distrito del Valle en el Valle de Shenandoah el 28 de mayo de 1863.[8].
En junio de 1863, el Ejército de Virginia del Norte del general Robert E. Lee había cruzado el río Potomac en la campaña de Gettysburg"). Trimble estaba desesperado por volver a la acción, sobre todo porque conocía la zona por sus días en el ferrocarril. Se unió al cuartel general de Lee sin ser solicitado, y se agotó en su estancia sin una asignación formal. Viajando hacia el norte, alcanzó al teniente general Richard S. Ewell en el camino a Harrisburg, Pensilvania, y se unió a su personal como supernumerario, u oficial superior sin mando. Él y Ewell discutieron con frecuencia debido a este torpe acuerdo y a la falta de tacto de Trimble.[9].
En la batalla de Gettysburg, el segundo cuerpo de Ewell llegó al campo de batalla a primera hora de la tarde del primer día, el 1 de julio de 1863, aplastando al XI cuerpo de la Unión y conduciéndolo hacia el sur a través de la ciudad hasta Cemetery Hill. Trimble escribió lo siguiente sobre su encuentro con Ewell:.
Los observadores han informado de que la "respuesta impaciente" fue: "Cuando necesito el consejo de un oficial subalterno, generalmente lo pido". También afirmaron que Trimble arrojó su espada con disgusto y se marchó enfadado. Una versión más colorida de este relato ha sido inmortalizada en la novela de Michael Shaara, Los ángeles asesinos.[11].
Gettysburg marcó el final de la carrera militar activa de Trimble. Pasó el siguiente año y medio en manos de los federales en Johnson's Island") y Fort Warren"). Se recomendó su libertad condicional poco después de la captura, pero el ex secretario de guerra de los Estados Unidos, Simon Cameron, lo desaconsejó, citando el conocimiento experto de Trimble sobre los ferrocarriles del norte. En marzo de 1865, el teniente general Ulysses S. Grant ordenó que Trimble fuera enviado a City Point, Virginia"), para su intercambio, pero cuando llegó allí, el ejército de Robert E. Lee ya se estaba retirando en la campaña de Appomattox"). Trimble fue finalmente puesto en libertad condicional en Lynchburg, Virginia "Lynchburg (Virginia)"), el 16 de abril de 1865, justo después de la rendición de Lee.[13].