Componentes principales

Los componentes centrales de un espectrofluorómetro forman la vía óptica y electrónica fundamental para excitar una muestra con longitudes de onda seleccionadas y detectar la emisión de fluorescencia resultante. Estos incluyen la fuente de luz, los monocromadores de excitación y emisión, el compartimento de muestras y el detector, dispuestos en una geometría de formato L donde la detección de la emisión se produce en un ángulo de 90 grados con respecto al haz de excitación para minimizar la interferencia de la luz dispersa.

La fuente de luz proporciona la iluminación de banda ancha necesaria para excitar los fluoróforos en un amplio rango espectral. Las lámparas de arco de xenón de alta intensidad son la opción estándar y ofrecen un espectro continuo de aproximadamente 200 a 2000 nm con potencias de salida que generalmente oscilan entre 150 y 1000 W, lo que permite una excitación versátil para diversas muestras. Para aplicaciones que requieren excitación precisa o monocromática, los láseres como los de diodo o los modelos sintonizables pueden reemplazar las lámparas de xenón, aunque limitan el rango espectral.[12]

El monocromador de excitación selecciona la longitud de onda deseada de la fuente de luz para la iluminación de la muestra. Este sistema basado en rejillas, que a menudo emplea un diseño de Czerny-Turner con rejillas de difracción planas, dispersa la luz de banda ancha y utiliza rendijas ajustables para controlar el ancho de banda espectral, generalmente de 1 a 20 nm, equilibrando la resolución y la intensidad de la señal.

En el compartimento de la muestra, la muestra excitada se aloja en una cubeta de cuarzo para garantizar la transparencia en el rango UV-visible, evitando las pérdidas por absorción que se producirían con el vidrio. La geometría de ángulo recto coloca la cubeta de manera que el haz de excitación ingresa a una cara mientras que la emisión se recoge perpendicularmente desde una cara adyacente, aprovechando el desplazamiento de Stokes donde la luz emitida tiene longitudes de onda más largas que la excitación para reducir la superposición.

El monocromador de emisión aísla la señal de fluorescencia de la luz dispersa o de fondo posterior a la muestra. De construcción similar al monocromador de excitación, escanea longitudes de onda más largas, pero puede incorporar un diseño de doble rejilla para lograr niveles de rechazo de luz parásita tan bajos como 10^{-8}, lo que mejora la sensibilidad para emisiones débiles.[15][16]

El detector convierte los fotones emitidos en una señal eléctrica para su análisis. Los tubos fotomultiplicadores (PMT) se utilizan predominantemente debido a su alta sensibilidad, que proporciona una ganancia interna de hasta 10 ^ 6 mediante la multiplicación de electrones, lo que amplifica eficazmente las señales de fluorescencia de bajo nivel. Los dispositivos de carga acoplada (CCD) sirven como alternativas para la detección basada en matrices, ofreciendo lectura simultánea de múltiples longitudes de onda pero con menor ganancia en comparación con los PMT.[17][18]

Componentes auxiliares

Los componentes auxiliares de un espectrofluorómetro mejoran la precisión, la estabilidad y la adaptabilidad de las mediciones al abordar el ruido, las influencias ambientales y el manejo de datos más allá de los elementos ópticos primarios. Estos incluyen dispositivos para modulación de señales, filtrado selectivo de luz, regulación térmica, procesamiento digital e interfaces de muestreo especializadas.

Un helicóptero o modulador actúa como un dispositivo mecánico o electroóptico que alterna el haz de luz de excitación para minimizar el ruido de fondo mediante técnicas de amplificación de bloqueo, que normalmente funcionan a frecuencias entre 10 y 100 Hz.[19] En los espectrómetros de fluorescencia, esta modulación suprime la luz parásita y la corriente oscura del detector, lo que permite la detección de señales de emisión débiles con relaciones señal-ruido mejoradas.[20]

Los filtros aumentan la selectividad en las mediciones; Los filtros de polarización, a menudo colocados antes de la muestra y el detector, facilitan las evaluaciones de anisotropía mediante el análisis de la difusión rotacional de fluoróforos bajo excitación polarizada.[21] Mientras tanto, los filtros de interferencia bloquean eficazmente la dispersión de Rayleigh (dispersión de luz elástica en la longitud de onda de excitación) mientras transmiten la fluorescencia de longitud de onda más larga, logrando densidades ópticas superiores a 10^5 para el rechazo de la luz parásita.[22]

Los sistemas de control de temperatura, como los refrigeradores Peltier o los baños circulantes integrados en los soportes de muestras, mantienen una estabilidad térmica precisa (por ejemplo, de 4 °C a 60 °C), esencial para los fluoróforos sensibles a la temperatura cuyos rendimientos cuánticos y vidas útiles varían con el calor.[23] Estos elementos termoeléctricos permiten un equilibrio rápido y una rampa automatizada, evitando distorsiones espectrales debidas a fluctuaciones térmicas.[24]

El sistema de adquisición de datos incorpora convertidores analógicos a digitales (ADC) para digitalizar las salidas de los detectores, a menudo con una resolución de 16 bits, junto con software para la corrección espectral en tiempo real para tener en cuenta las variaciones en la intensidad de la lámpara en las longitudes de onda.[25] Este procesamiento garantiza la precisión cuantitativa de los perfiles de emisiones, compensando las inestabilidades de la fuente sin intervención manual.[26]

Para mayor versatilidad con muestras no líquidas, las esferas integradoras permiten una iluminación uniforme y la recolección de fluorescencia de sólidos, una técnica perfeccionada en las décadas de 1970 y 1980 para el análisis de emisiones y reflectancia difusa.[27] De manera similar, las sondas de fibra óptica, desarrolladas durante la misma época, apoyan la detección remota transmitiendo excitación y emisión de luz a sitios inaccesibles, como entornos in vivo o industriales.[28] Los sistemas modernos suelen incluir cambiadores de muestras automatizados, lo que permite la detección de alto rendimiento de múltiples cubetas o microplacas para acelerar los ensayos biomédicos.[29]

Flujo de trabajo básico

El flujo de trabajo básico para adquirir un espectro de fluorescencia estándar mediante un espectrofluorómetro comienza con una preparación meticulosa de la muestra para garantizar mediciones precisas y sin interferencias. El fluoróforo se disuelve en un disolvente adecuado, como agua desionizada de alta pureza o etanol, para lograr una concentración típicamente en el rango de 10-610^{-6}10-6 a 10-910^{-9}10-9 M, que equilibra la sensibilidad con una autoabsorción mínima.[1] Se tiene cuidado de evitar extintores como el oxígeno disuelto o los metales pesados, a menudo desgasificando la solución con nitrógeno o usando condiciones anaeróbicas, ya que pueden reducir la intensidad de la fluorescencia de forma no radiativa.[1] La muestra preparada se coloca en una cubeta de cuarzo, se llena hasta aproximadamente dos tercios de su capacidad y se limpia el exterior para evitar artefactos formados por polvo o residuos.[30]

A continuación, se configura la configuración de excitación para optimizar la entrega de luz a la muestra. Se selecciona una longitud de onda de excitación adecuada en función del máximo de absorción del fluoróforo, como 280 nm para proteínas que contienen residuos de triptófano, utilizando el monocromador de excitación del instrumento.[1] Los anchos de las rendijas en los lados de excitación y emisión se ajustan, generalmente comenzando estrechos (por ejemplo, 1-5 nm) para una mayor resolución espectral, pero ampliándose si es necesario para aumentar la intensidad de la señal, compensando la resolución por una mejor relación señal-ruido en muestras de baja concentración.[1] Se deja que la lámpara de xenón se estabilice durante unos 30 minutos antes de continuar.[30]

Sigue el escaneo de emisiones, donde el detector, a menudo un tubo fotomultiplicador, registra la intensidad de la fluorescencia en función de la longitud de onda de emisión. El escaneo comienza justo más allá de la longitud de onda de excitación más el desplazamiento de Stokes (generalmente de 10 a 100 nm dependiendo del fluoróforo) para evitar la dispersión de Rayleigh y se extiende hasta alrededor de 800 nm para capturar el perfil de emisión completo. La geometría en ángulo recto entre las rutas de excitación y emisión minimiza la dispersión directa. Un escaneo típico demora entre 1 y 10 minutos, dependiendo de la configuración de velocidad y la resolución.[30]

El procesamiento de señales posterior a la adquisición es esencial para obtener datos confiables. La fluorescencia de fondo del disolvente se resta midiendo un blanco y deduciendo su espectro. Se aplican correcciones para el efecto del filtro interno, particularmente en concentraciones más altas donde la reabsorción de la luz emitida distorsiona las intensidades; esto implica ajustes matemáticos basados ​​en la absorbancia de la muestra.[32] La salida procesada se presenta como espectros de excitación o emisión (intensidad versus longitud de onda) o, para escaneos de múltiples longitudes de onda, gráficos tridimensionales. La relación fundamental que rige la intensidad de fluorescencia IfI_fIf​ está dada por

donde Φ\PhiΦ es el rendimiento cuántico, I0I_0I0​ es la intensidad de excitación incidente, ϵ\epsilonϵ es la absortividad molar, ccc es la concentración y lll es la longitud del camino; para concentraciones bajas donde ϵcl≪1\epsilon c l \ll 1ϵcl≪1, esto se aproxima a If≈Φ⋅I0⋅ϵclI_f \approx \Phi \cdot I_0 \cdot \epsilon c lIf​≈Φ⋅I0​⋅ϵcl, alineándose con la ley de Beer-Lambert para absorción luz.[33]

Técnicas de medición

En espectrofluorometría, los espectros de excitación se obtienen fijando el monocromador de emisión a una longitud de onda específica, generalmente la emisión máxima, y ​​escaneando el monocromador de excitación en un rango de longitudes de onda para identificar la longitud de onda de excitación óptima que maximiza la intensidad de la fluorescencia. Por el contrario, los espectros de emisión se registran seleccionando una longitud de onda de excitación fija, a menudo en el máximo de absorción, y escaneando el monocromador de emisión para capturar la salida de fluorescencia en función de la longitud de onda, revelando el cambio de Stokes y la forma espectral. Estos escaneos complementarios proporcionan datos esenciales para seleccionar longitudes de onda en análisis posteriores, ya que el espectro de excitación refleja el perfil de absorción mientras que el espectro de emisión refleja la distribución de energía en estado excitado relajado.

La medición de la fluorescencia resuelta en el tiempo amplía la espectrofluorometría en estado estacionario mediante el uso de fuentes de excitación pulsadas, como láseres, para sondear la caída temporal de la intensidad de la fluorescencia después de la excitación, lo que arroja información sobre la cinética de la caída y la dinámica del estado excitado.[34] La vida útil de la fluorescencia τ\tauτ, definida como el tiempo promedio que un fluoróforo pasa en estado excitado, surge de la competencia entre las vías de desintegración radiativa y no radiativa. La población en estado excitado N∗(t)N^(t)N∗(t) sigue la ecuación diferencial dN∗dt=−(kf+knr)N∗\frac{dN^}{dt} = -(k_f + k_{nr}) N^dtdN∗​=−(kf​+knr​)N∗, donde kfk_fkf​ es la desintegración radiativa constante de velocidad y knrk_{nr}knr​ es la suma de todas las constantes de velocidad de desintegración no radiativa, incluida la conversión interna, el cruce entre sistemas y la extinción.[35] Resolver esta ecuación diferencial de primer orden con la condición inicial N∗(0)=N0N^(0) = N_0N∗(0)=N0​ da N∗(t)=N0e−t/τN^(t) = N_0 e^{-t/\tau}N∗(t)=N0​e−t/τ, donde la intensidad de fluorescencia I(t)∝N∗(t)I(t) \propto N^(t)I(t)∝N∗(t). Por lo tanto, τ=1kf+knr\tau = \frac{1}{k_f + k_{nr}}τ=kf​+knr​1​, cuantifica la tasa de desintegración total y permite separar la eficiencia radiativa de las influencias ambientales.[35] Esta técnica es particularmente valiosa para distinguir fluoróforos con espectros de estado estacionario superpuestos basados ​​en diferencias de vida útil.

La anisotropía de fluorescencia, o polarización, mide la difusión rotacional de los fluoróforos durante su vida en estado excitado mediante excitación y detección polarizadas, lo que proporciona información sobre el tamaño, la forma y las interacciones de unión de las moléculas.[36] La excitación con luz polarizada verticalmente selecciona fluoróforos orientados paralelos al eje de polarización, y la polarización de la luz emitida depende del grado de rotación durante τ\tauτ. La anisotropía de estado estacionario rrr se calcula como r=I∥−I⊥I∥+2I⊥r = \frac{I_{\parallel} - I_{\perp}}{I_{\parallel} + 2 I_{\perp}}r=I∥​+2I⊥​I∥​−I⊥​, donde I∥I_{\parallel}I∥​ y I⊥I_{\perp}I⊥​ son las intensidades de fluorescencia paralelas y perpendiculares a la polarización de excitación, respectivamente.[36] Esta métrica derivada de la ecuación de Perrin, introducida por Weber en 1952, disminuye al aumentar la movilidad rotacional, a medida que una rotación más rápida aleatoriza la polarización de las emisiones.

Análisis Biomédico y Químico

Los espectrofluorómetros desempeñan un papel crucial en el análisis biomédico y químico al permitir la detección sensible de interacciones y concentraciones biomoleculares a través de mediciones de fluorescencia. En la cuantificación de proteínas, la fluorescencia intrínseca de aminoácidos aromáticos como el triptófano (emisión alrededor de 350 nm tras la excitación a 280 nm) y la tirosina permite la evaluación directa del contenido de proteínas sin etiquetado adicional, lo que proporciona un método no destructivo superior a las técnicas basadas en absorbancia para muestras de baja concentración.[37] Para la cuantificación del ADN, se emplean colorantes fluorescentes extrínsecos como PicoGreen, que se intercalan específicamente con el ADN bicatenario; la mejora resultante en la intensidad de la fluorescencia (excitación a 480 nm, emisión a 520 nm) permite una medición precisa hasta niveles de picogramos en configuraciones espectrofluorométricas. Los ensayos de unión aprovechan aún más la extinción de la fluorescencia, donde la interacción de proteínas con ligandos reduce la intensidad de la emisión de triptófano, lo que permite a los investigadores monitorear la afinidad y la estequiometría en tiempo real.

Los estudios de cinética enzimática se benefician de la capacidad de la espectrofluorometría para rastrear cambios en tiempo real en la fluorescencia a medida que los sustratos se convierten en productos fluorescentes o viceversa, ofreciendo parámetros cinéticos como la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima (Vmax) con alta resolución temporal. Por ejemplo, los ensayos que monitorean la hidrólisis de sustratos fluorogénicos proporcionan datos continuos sobre el progreso de la reacción, esenciales para comprender los mecanismos catalíticos en las vías bioquímicas.[40] En el descubrimiento de fármacos, los espectrofluorómetros facilitan la detección de alto rendimiento de compuestos marcados con fluoróforos, donde la polarización de la fluorescencia o los cambios de intensidad indican la unión a proteínas objetivo, lo que permite una rápida identificación de los resultados; las curvas dosis-respuesta posteriores arrojan valores de concentración inhibidora media máxima (CI50) para la optimización de derivaciones.[41] Este enfoque ha acelerado la evaluación de miles de candidatos en ensayos de enzimas como quinasas y proteasas.

Una aplicación fundamental en los estudios metabólicos implica la fluorescencia del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) reducido, excitado a 340 nm con emisión a 460 nm, que sirve como indicador endógeno del estado redox celular; Esta técnica, iniciada por Britton Chance en la década de 1950, ha sido fundamental para la monitorización no invasiva de la función mitocondrial y la fosforilación oxidativa en tejidos vivos.[42] Para los ensayos de viabilidad celular, se cargan en las células colorantes extrínsecos como el diacetato de fluoresceína, donde la actividad esterasa en las células viables la hidroliza a fluoresceína fluorescente (excitación 488 nm, emisión 520 nm), lo que permite la cuantificación espectrofluorométrica de poblaciones de células vivas en experimentos basados ​​en suspensión.[43] La alta sensibilidad de la espectrofluorometría, que a menudo detecta concentraciones de fluoróforos nanomolares, respalda estas aplicaciones biomédicas al permitir análisis precisos en matrices biológicas complejas.[44]

Usos ambientales e industriales

Los espectrofluorómetros desempeñan un papel crucial en la vigilancia ambiental al permitir la detección de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en el agua, incluso a través de matrices de excitación-emisión que proporcionan huellas dactilares características para identificar estos contaminantes.[45] La detección de fluorescencia se ha integrado en los métodos de la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de EE. UU., como el Método 610 (establecido en 1984), lo que permite la cuantificación sensible de HAP como el acenafteno y el antraceno en agua potable y superficial en concentraciones tan bajas como partes por mil millones.[46] Estas técnicas basadas en fluorescencia aprovechan las propiedades emisivas inherentes de los HAP bajo excitación ultravioleta, lo que facilita la detección rápida sin un tratamiento previo extenso de la muestra.

En la respuesta a derrames de petróleo, la espectrofluorometría distingue entre petróleo crudo y refinado mediante el análisis de sus distintos espectros de emisión, que reflejan diferencias en la composición de compuestos aromáticos.[47] Por ejemplo, los petróleos crudos suelen exhibir picos de fluorescencia más amplios y desplazados al rojo debido a un mayor contenido policíclico, mientras que los productos refinados muestran espectros más estrechos debido a la reducción de aromáticos pesados, lo que permite la clasificación in situ durante las evaluaciones de derrames.[48] Esta diferenciación apoya los esfuerzos de remediación ambiental al identificar las fuentes de derrames y rastrear la dispersión en ambientes marinos o costeros.

Las aplicaciones de teledetección avanzaron en la década de 1990 con el desarrollo de sondas de fibra óptica acopladas a espectrofluorómetros para el análisis de la contaminación del suelo in situ, lo que permitió mediciones directas de fluorescencia sin extracción del suelo.[49] Estas sondas, a menudo equipadas con fuentes de excitación láser, detectan contaminantes fluorescentes como HAP o hidrocarburos de petróleo a profundidades de hasta varios metros, proporcionando datos en tiempo real para la caracterización del sitio y el monitoreo de la limpieza.[50]

En la industria alimentaria, los espectrofluorómetros detectan adulterantes como la melamina en la leche mediante sondas fluorescentes etiquetadas que muestran extinción o mejora al unirse, lo que garantiza la seguridad del producto y el cumplimiento normativo.[51] Por ejemplo, las sondas a base de lantánidos forman complejos con melamina, lo que da como resultado una emisión intensificada en longitudes de onda específicas mensurables mediante espectrofluorometría, con límites de detección inferiores a 1 ppm adecuados para el control de calidad de rutina.[52]

La fabricación farmacéutica emplea espectrofluorómetros para evaluar la pureza mediante la identificación y cuantificación de impurezas fluorescentes en sustancias y formulaciones farmacológicas.[53] Las técnicas implican excitar muestras en longitudes de onda óptimas para monitorear las emisiones de impurezas, como las de aminas genotóxicas como la 2-aminopiridina, lo que garantiza el cumplimiento de los límites de la farmacopea mediante la detección de fluorescencia de alta sensibilidad.[53] La selectividad de este método para fluoróforos aromáticos ayuda en la validación del proceso y las pruebas de liberación de lotes.

Fortalezas

Los espectrofluorómetros ofrecen una sensibilidad excepcional, capaces de detectar fluoróforos en concentraciones tan bajas como 10−1210^{-12}10−12 M, debido a la medición de las señales de fluorescencia emitidas contra un ruido de fondo bajo, generalmente cercano a cero en ausencia de emisión.[54] Esto contrasta marcadamente con las técnicas basadas en absorción, donde la sensibilidad está limitada por la necesidad de diferenciar pequeñas diferencias en la intensidad de la luz transmitida de un fondo brillante, lo que da como resultado que los métodos de fluorescencia sean de 1.000 a 10.000 veces más sensibles que la espectroscopia de absorción UV-Vis regida por la ley de Beer-Lambert.[55]

La técnica proporciona una alta selectividad a través del control preciso de las longitudes de onda de excitación, lo que minimiza la interferencia de especies no fluorescentes o aquellas con perfiles de emisión no coincidentes, lo que permite el análisis específico de analitos específicos en mezclas complejas.[56] Además, la generación de matrices de excitación-emisión (EEM) produce datos espectrales multidimensionales, lo que permite la discriminación de múltiples fluoróforos en función de sus firmas únicas de excitación y emisión, lo que mejora la resolución en muestras con espectros superpuestos.[57]

Como método no destructivo, la espectrofluorometría preserva la integridad de la muestra, lo que permite su reutilización para análisis o experimentos posteriores sin alteración, lo cual es particularmente ventajoso para cantidades valiosas o limitadas de material.[58]

Los espectrofluorómetros demuestran versatilidad en diversos tipos de muestras, incluidos líquidos, sólidos, suspensiones y gases, mediante el uso de accesorios adecuados, como cubetas, soportes frontales o celdas de flujo, ampliando su utilidad en diversos contextos analíticos.[59]

Desafíos y consideraciones

Un desafío importante en la espectrofluorometría es el fotoblanqueo, la degradación irreversible de los fluoróforos debido a la exposición prolongada a la luz de excitación, que reduce la intensidad de la señal con el tiempo y limita la duración de la medición.[60] Este proceso se ve exacerbado por la alta intensidad de la luz y las especies reactivas de oxígeno, lo que lleva a modificaciones covalentes en la estructura del fluoróforo.[61] Las estrategias de mitigación incluyen el uso de intensidades de excitación bajas, minimizar los tiempos de exposición y emplear agentes antivaho o eliminadores de oxígeno para preservar la integridad de la muestra durante el análisis.[62]

Los efectos de filtro interno y externo surgen de la absorción de la luz de excitación o emisión por la propia muestra, distorsionando la intensidad de la fluorescencia y la forma espectral, particularmente en soluciones concentradas donde la absorbancia excede 0,1.[32] El efecto de filtro interno primario ocurre cuando la luz de excitación se reabsorbe antes de llegar a todos los fluoróforos, mientras que el efecto secundario implica la reabsorción de la luz emitida; Los efectos del filtro exterior se derivan de procesos similares en las paredes de la cubeta.[63] Una corrección común para los efectos del filtro interno primario y secundario utiliza la fórmula Fcorr=Fobs×10(Aex+Aem)/2F_{\text{corr}} = F_{\text{obs}} \times 10^{(A_{\text{ex}} + A_{\text{em}})/2}Fcorr​=Fobs​×10(Aex​+Aem​)/2, donde FobsF_{\text{obs}}Fobs​ es la intensidad observada, y AexA_{\text{ex}}Aex​ y AemA_{\text{em}}Aem​ son las absorbancias en las longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente, suponiendo un modelo simple para valores de absorbancia bajos a moderados en una cubeta de 1 cm.[64] Las correcciones precisas requieren la medición simultánea de los espectros de absorbancia y pueden implicar modelos más sofisticados para muestras de alta concentración.[65]

Los artefactos de dispersión, como la dispersión Rayleigh (elástica) y Tyndall (coloidal), introducen ruido de fondo que se superpone con las señales de fluorescencia, especialmente en muestras turbias o de partículas, lo que reduce la sensibilidad y la precisión. Estos efectos son prominentes cuando las longitudes de onda de emisión están cercanas a las longitudes de onda de excitación, ya que la luz dispersada sigue el mismo perfil espectral.[66] La reducción se logra mediante la geometría de detección estándar de 90 grados, que minimiza la dispersión directa del haz de excitación, combinada con filtros de corte o polarizadores para suprimir la luz no deseada.

La deriva del instrumento, a menudo causada por el envejecimiento de la lámpara en fuentes de xenón o deuterio, produce variaciones en la intensidad de excitación y la salida espectral a lo largo del tiempo, comprometiendo la reproducibilidad entre las mediciones.[67] Esta deriva puede alterar la fluorescencia inicial hasta en varios porcentajes por hora sin intervención.[68] La calibración diaria utilizando estándares estables como el sulfato de quinina en ácido sulfúrico es esencial para normalizar la intensidad y corregir estas inestabilidades, asegurando la trazabilidad hasta las referencias primarias.[69]

Los desafíos modernos en espectrofluorometría incluyen el manejo de nanomateriales como los puntos cuánticos, que surgieron de manera prominente después del año 2000 por sus propiedades de emisión sintonizables pero que presentan problemas como el fotoparpadeo (fluorescencia intermitente debido a la captura de carga) y la polidispersidad del tamaño que afecta la uniformidad espectral. Estas propiedades complican el análisis cuantitativo en medios complejos y requieren protocolos especializados para la estabilización y caracterización.[71]

Para analizar mezclas complejas con espectros superpuestos, las mejores prácticas implican software de deconvolución espectral que emplea métodos multivariados como desmezcla lineal o análisis de componentes principales para resolver las contribuciones de fluoróforos individuales sin separación previa.[72] Herramientas como las basadas en la factorización de matrices no negativas permiten una identificación precisa de los componentes mediante el modelado de matrices de excitación-emisión, lo que mejora la resolución en muestras biológicas o ambientales.[73]

Definición y propósito

Un espectrofluorómetro es un instrumento analítico especializado diseñado para medir la intensidad de la fluorescencia emitida por una muestra en función de las longitudes de onda de excitación y emisión, proporcionando información espectral detallada para la caracterización. Introducción a la espectroscopia de fluorescencia A diferencia de los fluorímetros más simples, que normalmente usan filtros para la selección de longitudes de onda, los espectrofluorómetros incorporan monocromadores de barrido, a menudo basados en rejillas de difracción, para lograr una alta resolución espectral y flexibilidad en la selección de longitudes de onda precisas. Fluorescencia y fosforescencia Instrumentación

El instrumento fue inventado a principios de la década de 1950 por Robert L. Bowman, un ingeniero, y Sidney Udenfriend, un bioquímico, en el Instituto Nacional del Corazón, donde desarrollaron el primer espectrofotofluorímetro para aplicaciones en bioquímica y farmacología. Espectrofotofluorímetro Su propósito principal es permitir la identificación cualitativa y la determinación cuantitativa de moléculas fluorescentes en muestras complejas, aprovechando la sensibilidad inherente de la fluorescencia para detectar analitos en concentraciones muy bajas, a menudo hasta partes por mil millones o incluso partes por billón para compuestos altamente fluorescentes como el sulfato de quinina. Evaluación de la luminiscencia molecular

Los espectrofluorómetros suelen operar en el rango de longitud de onda ultravioleta-visible (UV-Vis) de aproximadamente 200 a 800 nm, lo que permite la excitación de muestras con luz en este espectro mientras capturan la emisión resultante. Fundamentos de la excitación y emisión de fluorescencia Una característica clave de la fluorescencia es el desplazamiento de Stokes, donde la luz emitida ocurre en longitudes de onda más largas que la luz de excitación debido a la pérdida de energía a través de la relajación vibratoria, lo que minimiza la interferencia de la luz de excitación dispersa y mejora la medición. Precisión.Stokes Shift

Principios de fluorescencia

La fluorescencia fue descrita científicamente por primera vez en 1852 por George Gabriel Stokes, quien observó el fenómeno en el espato flúor (fluorita) y acuñó el término en referencia a la emisión azul-blanca del mineral bajo luz ultravioleta.

La fluorescencia es un tipo de fotoluminiscencia en el que una molécula absorbe un fotón de luz, excitando un electrón del estado fundamental a un estado excitado singlete de mayor energía, seguido de la emisión de un fotón en una longitud de onda más larga a medida que el electrón regresa al estado fundamental. Este proceso ocurre en el orden de nanosegundos e involucra solo estados singlete, lo que lo distingue de la fosforescencia, que implica una transición prohibida por espín a un estado excitado triplete y da como resultado vidas de emisión mucho más largas que van desde milisegundos a segundos. Los fluoróforos, las moléculas capaces de producir fluorescencia, suelen presentar sistemas de electrones π conjugados que permiten electrones deslocalizados y una absorción y emisión de luz eficientes; Los ejemplos comunes incluyen compuestos aromáticos como la quinina, que exhibe una fuerte fluorescencia debido a su estructura de quinolina.

Las transiciones de energía en la fluorescencia se ilustran mediante el diagrama de Jablonski, que representa el estado singlete fundamental (S₀) y el primer estado singlete excitado (S₁), junto con los subniveles vibratorios dentro de cada estado electrónico. Tras la absorción de luz, la molécula asciende de S₀ a S₁, a menudo a un nivel vibratorio más alto, seguido de una rápida relajación vibratoria hasta el nivel vibratorio más bajo de S₁ (en la escala de tiempo de picosegundos). A partir de ahí, los procesos no radiativos como la conversión interna pueden competir, pero la emisión de fluorescencia se produce cuando el electrón se relaja nuevamente a S₀, generalmente a un nivel vibratorio más alto que el original, liberando un fotón de menor energía.[6] Esta pérdida de energía durante la relajación explica el cambio de Stokes, donde la luz emitida tiene una longitud de onda más larga (menor energía) que la luz absorbida, típicamente en el rango de 10 a 100 nm, según el fluoróforo y el entorno del solvente.

La eficiencia de la fluorescencia se cuantifica mediante el rendimiento cuántico, definido como Φ=número de fotones emitidos número de fotones absorbidos\Phi = \frac{\text{número de fotones emitidos}}{\text{número de fotones absorbidos}}Φ=número de fotones absorbidos número de fotones emitidos, que va de 0 a 1 y representa la fracción de moléculas excitadas que emiten luz en lugar de disipar energía a través de vías no radiativas.[7] Los factores que influyen en el rendimiento cuántico incluyen la estructura molecular (p. ej., rigidez del sistema conjugado para minimizar las pérdidas por vibración) y condiciones ambientales como la polaridad del disolvente, el pH y la presencia de extintores, que pueden reducir Φ\PhiΦ proporcionando rutas de desintegración alternativas.[5] Los altos rendimientos cuánticos, como se observan en fluoróforos como la fluoresceína (Φ≈0,95\Phi \approx 0,95Φ≈0,95 en solución acuosa básica), son deseables para la detección sensible en espectrofluorometría.

Componentes principales

Los componentes centrales de un espectrofluorómetro forman la vía óptica y electrónica fundamental para excitar una muestra con longitudes de onda seleccionadas y detectar la emisión de fluorescencia resultante. Estos incluyen la fuente de luz, los monocromadores de excitación y emisión, el compartimento de muestras y el detector, dispuestos en una geometría de formato L donde la detección de la emisión se produce en un ángulo de 90 grados con respecto al haz de excitación para minimizar la interferencia de la luz dispersa.

La fuente de luz proporciona la iluminación de banda ancha necesaria para excitar los fluoróforos en un amplio rango espectral. Las lámparas de arco de xenón de alta intensidad son la opción estándar y ofrecen un espectro continuo de aproximadamente 200 a 2000 nm con potencias de salida que generalmente oscilan entre 150 y 1000 W, lo que permite una excitación versátil para diversas muestras. Para aplicaciones que requieren excitación precisa o monocromática, los láseres como los de diodo o los modelos sintonizables pueden reemplazar las lámparas de xenón, aunque limitan el rango espectral.[12]

El monocromador de excitación selecciona la longitud de onda deseada de la fuente de luz para la iluminación de la muestra. Este sistema basado en rejillas, que a menudo emplea un diseño de Czerny-Turner con rejillas de difracción planas, dispersa la luz de banda ancha y utiliza rendijas ajustables para controlar el ancho de banda espectral, generalmente de 1 a 20 nm, equilibrando la resolución y la intensidad de la señal.

En el compartimento de la muestra, la muestra excitada se aloja en una cubeta de cuarzo para garantizar la transparencia en el rango UV-visible, evitando las pérdidas por absorción que se producirían con el vidrio. La geometría de ángulo recto coloca la cubeta de manera que el haz de excitación ingresa a una cara mientras que la emisión se recoge perpendicularmente desde una cara adyacente, aprovechando el desplazamiento de Stokes donde la luz emitida tiene longitudes de onda más largas que la excitación para reducir la superposición.

El monocromador de emisión aísla la señal de fluorescencia de la luz dispersa o de fondo posterior a la muestra. De construcción similar al monocromador de excitación, escanea longitudes de onda más largas, pero puede incorporar un diseño de doble rejilla para lograr niveles de rechazo de luz parásita tan bajos como 10^{-8}, lo que mejora la sensibilidad para emisiones débiles.[15][16]

El detector convierte los fotones emitidos en una señal eléctrica para su análisis. Los tubos fotomultiplicadores (PMT) se utilizan predominantemente debido a su alta sensibilidad, que proporciona una ganancia interna de hasta 10 ^ 6 mediante la multiplicación de electrones, lo que amplifica eficazmente las señales de fluorescencia de bajo nivel. Los dispositivos de carga acoplada (CCD) sirven como alternativas para la detección basada en matrices, ofreciendo lectura simultánea de múltiples longitudes de onda pero con menor ganancia en comparación con los PMT.[17][18]

Componentes auxiliares

Los componentes auxiliares de un espectrofluorómetro mejoran la precisión, la estabilidad y la adaptabilidad de las mediciones al abordar el ruido, las influencias ambientales y el manejo de datos más allá de los elementos ópticos primarios. Estos incluyen dispositivos para modulación de señales, filtrado selectivo de luz, regulación térmica, procesamiento digital e interfaces de muestreo especializadas.

Un helicóptero o modulador actúa como un dispositivo mecánico o electroóptico que alterna el haz de luz de excitación para minimizar el ruido de fondo mediante técnicas de amplificación de bloqueo, que normalmente funcionan a frecuencias entre 10 y 100 Hz.[19] En los espectrómetros de fluorescencia, esta modulación suprime la luz parásita y la corriente oscura del detector, lo que permite la detección de señales de emisión débiles con relaciones señal-ruido mejoradas.[20]

Los filtros aumentan la selectividad en las mediciones; Los filtros de polarización, a menudo colocados antes de la muestra y el detector, facilitan las evaluaciones de anisotropía mediante el análisis de la difusión rotacional de fluoróforos bajo excitación polarizada.[21] Mientras tanto, los filtros de interferencia bloquean eficazmente la dispersión de Rayleigh (dispersión de luz elástica en la longitud de onda de excitación) mientras transmiten la fluorescencia de longitud de onda más larga, logrando densidades ópticas superiores a 10^5 para el rechazo de la luz parásita.[22]

Los sistemas de control de temperatura, como los refrigeradores Peltier o los baños circulantes integrados en los soportes de muestras, mantienen una estabilidad térmica precisa (por ejemplo, de 4 °C a 60 °C), esencial para los fluoróforos sensibles a la temperatura cuyos rendimientos cuánticos y vidas útiles varían con el calor.[23] Estos elementos termoeléctricos permiten un equilibrio rápido y una rampa automatizada, evitando distorsiones espectrales debidas a fluctuaciones térmicas.[24]

El sistema de adquisición de datos incorpora convertidores analógicos a digitales (ADC) para digitalizar las salidas de los detectores, a menudo con una resolución de 16 bits, junto con software para la corrección espectral en tiempo real para tener en cuenta las variaciones en la intensidad de la lámpara en las longitudes de onda.[25] Este procesamiento garantiza la precisión cuantitativa de los perfiles de emisiones, compensando las inestabilidades de la fuente sin intervención manual.[26]

Para mayor versatilidad con muestras no líquidas, las esferas integradoras permiten una iluminación uniforme y la recolección de fluorescencia de sólidos, una técnica perfeccionada en las décadas de 1970 y 1980 para el análisis de emisiones y reflectancia difusa.[27] De manera similar, las sondas de fibra óptica, desarrolladas durante la misma época, apoyan la detección remota transmitiendo excitación y emisión de luz a sitios inaccesibles, como entornos in vivo o industriales.[28] Los sistemas modernos suelen incluir cambiadores de muestras automatizados, lo que permite la detección de alto rendimiento de múltiples cubetas o microplacas para acelerar los ensayos biomédicos.[29]

Flujo de trabajo básico

El flujo de trabajo básico para adquirir un espectro de fluorescencia estándar mediante un espectrofluorómetro comienza con una preparación meticulosa de la muestra para garantizar mediciones precisas y sin interferencias. El fluoróforo se disuelve en un disolvente adecuado, como agua desionizada de alta pureza o etanol, para lograr una concentración típicamente en el rango de 10-610^{-6}10-6 a 10-910^{-9}10-9 M, que equilibra la sensibilidad con una autoabsorción mínima.[1] Se tiene cuidado de evitar extintores como el oxígeno disuelto o los metales pesados, a menudo desgasificando la solución con nitrógeno o usando condiciones anaeróbicas, ya que pueden reducir la intensidad de la fluorescencia de forma no radiativa.[1] La muestra preparada se coloca en una cubeta de cuarzo, se llena hasta aproximadamente dos tercios de su capacidad y se limpia el exterior para evitar artefactos formados por polvo o residuos.[30]

A continuación, se configura la configuración de excitación para optimizar la entrega de luz a la muestra. Se selecciona una longitud de onda de excitación adecuada en función del máximo de absorción del fluoróforo, como 280 nm para proteínas que contienen residuos de triptófano, utilizando el monocromador de excitación del instrumento.[1] Los anchos de las rendijas en los lados de excitación y emisión se ajustan, generalmente comenzando estrechos (por ejemplo, 1-5 nm) para una mayor resolución espectral, pero ampliándose si es necesario para aumentar la intensidad de la señal, compensando la resolución por una mejor relación señal-ruido en muestras de baja concentración.[1] Se deja que la lámpara de xenón se estabilice durante unos 30 minutos antes de continuar.[30]

Sigue el escaneo de emisiones, donde el detector, a menudo un tubo fotomultiplicador, registra la intensidad de la fluorescencia en función de la longitud de onda de emisión. El escaneo comienza justo más allá de la longitud de onda de excitación más el desplazamiento de Stokes (generalmente de 10 a 100 nm dependiendo del fluoróforo) para evitar la dispersión de Rayleigh y se extiende hasta alrededor de 800 nm para capturar el perfil de emisión completo. La geometría en ángulo recto entre las rutas de excitación y emisión minimiza la dispersión directa. Un escaneo típico demora entre 1 y 10 minutos, dependiendo de la configuración de velocidad y la resolución.[30]

El procesamiento de señales posterior a la adquisición es esencial para obtener datos confiables. La fluorescencia de fondo del disolvente se resta midiendo un blanco y deduciendo su espectro. Se aplican correcciones para el efecto del filtro interno, particularmente en concentraciones más altas donde la reabsorción de la luz emitida distorsiona las intensidades; esto implica ajustes matemáticos basados ​​en la absorbancia de la muestra.[32] La salida procesada se presenta como espectros de excitación o emisión (intensidad versus longitud de onda) o, para escaneos de múltiples longitudes de onda, gráficos tridimensionales. La relación fundamental que rige la intensidad de fluorescencia IfI_fIf​ está dada por

donde Φ\PhiΦ es el rendimiento cuántico, I0I_0I0​ es la intensidad de excitación incidente, ϵ\epsilonϵ es la absortividad molar, ccc es la concentración y lll es la longitud del camino; para concentraciones bajas donde ϵcl≪1\epsilon c l \ll 1ϵcl≪1, esto se aproxima a If≈Φ⋅I0⋅ϵclI_f \approx \Phi \cdot I_0 \cdot \epsilon c lIf​≈Φ⋅I0​⋅ϵcl, alineándose con la ley de Beer-Lambert para absorción luz.[33]

Técnicas de medición

En espectrofluorometría, los espectros de excitación se obtienen fijando el monocromador de emisión a una longitud de onda específica, generalmente la emisión máxima, y ​​escaneando el monocromador de excitación en un rango de longitudes de onda para identificar la longitud de onda de excitación óptima que maximiza la intensidad de la fluorescencia. Por el contrario, los espectros de emisión se registran seleccionando una longitud de onda de excitación fija, a menudo en el máximo de absorción, y escaneando el monocromador de emisión para capturar la salida de fluorescencia en función de la longitud de onda, revelando el cambio de Stokes y la forma espectral. Estos escaneos complementarios proporcionan datos esenciales para seleccionar longitudes de onda en análisis posteriores, ya que el espectro de excitación refleja el perfil de absorción mientras que el espectro de emisión refleja la distribución de energía en estado excitado relajado.

La medición de la fluorescencia resuelta en el tiempo amplía la espectrofluorometría en estado estacionario mediante el uso de fuentes de excitación pulsadas, como láseres, para sondear la caída temporal de la intensidad de la fluorescencia después de la excitación, lo que arroja información sobre la cinética de la caída y la dinámica del estado excitado.[34] La vida útil de la fluorescencia τ\tauτ, definida como el tiempo promedio que un fluoróforo pasa en estado excitado, surge de la competencia entre las vías de desintegración radiativa y no radiativa. La población en estado excitado N∗(t)N^(t)N∗(t) sigue la ecuación diferencial dN∗dt=−(kf+knr)N∗\frac{dN^}{dt} = -(k_f + k_{nr}) N^dtdN∗​=−(kf​+knr​)N∗, donde kfk_fkf​ es la desintegración radiativa constante de velocidad y knrk_{nr}knr​ es la suma de todas las constantes de velocidad de desintegración no radiativa, incluida la conversión interna, el cruce entre sistemas y la extinción.[35] Resolver esta ecuación diferencial de primer orden con la condición inicial N∗(0)=N0N^(0) = N_0N∗(0)=N0​ da N∗(t)=N0e−t/τN^(t) = N_0 e^{-t/\tau}N∗(t)=N0​e−t/τ, donde la intensidad de fluorescencia I(t)∝N∗(t)I(t) \propto N^(t)I(t)∝N∗(t). Por lo tanto, τ=1kf+knr\tau = \frac{1}{k_f + k_{nr}}τ=kf​+knr​1​, cuantifica la tasa de desintegración total y permite separar la eficiencia radiativa de las influencias ambientales.[35] Esta técnica es particularmente valiosa para distinguir fluoróforos con espectros de estado estacionario superpuestos basados ​​en diferencias de vida útil.

La anisotropía de fluorescencia, o polarización, mide la difusión rotacional de los fluoróforos durante su vida en estado excitado mediante excitación y detección polarizadas, lo que proporciona información sobre el tamaño, la forma y las interacciones de unión de las moléculas.[36] La excitación con luz polarizada verticalmente selecciona fluoróforos orientados paralelos al eje de polarización, y la polarización de la luz emitida depende del grado de rotación durante τ\tauτ. La anisotropía de estado estacionario rrr se calcula como r=I∥−I⊥I∥+2I⊥r = \frac{I_{\parallel} - I_{\perp}}{I_{\parallel} + 2 I_{\perp}}r=I∥​+2I⊥​I∥​−I⊥​, donde I∥I_{\parallel}I∥​ y I⊥I_{\perp}I⊥​ son las intensidades de fluorescencia paralelas y perpendiculares a la polarización de excitación, respectivamente.[36] Esta métrica derivada de la ecuación de Perrin, introducida por Weber en 1952, disminuye al aumentar la movilidad rotacional, a medida que una rotación más rápida aleatoriza la polarización de las emisiones.

Análisis Biomédico y Químico

Los espectrofluorómetros desempeñan un papel crucial en el análisis biomédico y químico al permitir la detección sensible de interacciones y concentraciones biomoleculares a través de mediciones de fluorescencia. En la cuantificación de proteínas, la fluorescencia intrínseca de aminoácidos aromáticos como el triptófano (emisión alrededor de 350 nm tras la excitación a 280 nm) y la tirosina permite la evaluación directa del contenido de proteínas sin etiquetado adicional, lo que proporciona un método no destructivo superior a las técnicas basadas en absorbancia para muestras de baja concentración.[37] Para la cuantificación del ADN, se emplean colorantes fluorescentes extrínsecos como PicoGreen, que se intercalan específicamente con el ADN bicatenario; la mejora resultante en la intensidad de la fluorescencia (excitación a 480 nm, emisión a 520 nm) permite una medición precisa hasta niveles de picogramos en configuraciones espectrofluorométricas. Los ensayos de unión aprovechan aún más la extinción de la fluorescencia, donde la interacción de proteínas con ligandos reduce la intensidad de la emisión de triptófano, lo que permite a los investigadores monitorear la afinidad y la estequiometría en tiempo real.

Los estudios de cinética enzimática se benefician de la capacidad de la espectrofluorometría para rastrear cambios en tiempo real en la fluorescencia a medida que los sustratos se convierten en productos fluorescentes o viceversa, ofreciendo parámetros cinéticos como la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima (Vmax) con alta resolución temporal. Por ejemplo, los ensayos que monitorean la hidrólisis de sustratos fluorogénicos proporcionan datos continuos sobre el progreso de la reacción, esenciales para comprender los mecanismos catalíticos en las vías bioquímicas.[40] En el descubrimiento de fármacos, los espectrofluorómetros facilitan la detección de alto rendimiento de compuestos marcados con fluoróforos, donde la polarización de la fluorescencia o los cambios de intensidad indican la unión a proteínas objetivo, lo que permite una rápida identificación de los resultados; las curvas dosis-respuesta posteriores arrojan valores de concentración inhibidora media máxima (CI50) para la optimización de derivaciones.[41] Este enfoque ha acelerado la evaluación de miles de candidatos en ensayos de enzimas como quinasas y proteasas.

Una aplicación fundamental en los estudios metabólicos implica la fluorescencia del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) reducido, excitado a 340 nm con emisión a 460 nm, que sirve como indicador endógeno del estado redox celular; Esta técnica, iniciada por Britton Chance en la década de 1950, ha sido fundamental para la monitorización no invasiva de la función mitocondrial y la fosforilación oxidativa en tejidos vivos.[42] Para los ensayos de viabilidad celular, se cargan en las células colorantes extrínsecos como el diacetato de fluoresceína, donde la actividad esterasa en las células viables la hidroliza a fluoresceína fluorescente (excitación 488 nm, emisión 520 nm), lo que permite la cuantificación espectrofluorométrica de poblaciones de células vivas en experimentos basados ​​en suspensión.[43] La alta sensibilidad de la espectrofluorometría, que a menudo detecta concentraciones de fluoróforos nanomolares, respalda estas aplicaciones biomédicas al permitir análisis precisos en matrices biológicas complejas.[44]

Usos ambientales e industriales

Los espectrofluorómetros desempeñan un papel crucial en la vigilancia ambiental al permitir la detección de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en el agua, incluso a través de matrices de excitación-emisión que proporcionan huellas dactilares características para identificar estos contaminantes.[45] La detección de fluorescencia se ha integrado en los métodos de la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de EE. UU., como el Método 610 (establecido en 1984), lo que permite la cuantificación sensible de HAP como el acenafteno y el antraceno en agua potable y superficial en concentraciones tan bajas como partes por mil millones.[46] Estas técnicas basadas en fluorescencia aprovechan las propiedades emisivas inherentes de los HAP bajo excitación ultravioleta, lo que facilita la detección rápida sin un tratamiento previo extenso de la muestra.

En la respuesta a derrames de petróleo, la espectrofluorometría distingue entre petróleo crudo y refinado mediante el análisis de sus distintos espectros de emisión, que reflejan diferencias en la composición de compuestos aromáticos.[47] Por ejemplo, los petróleos crudos suelen exhibir picos de fluorescencia más amplios y desplazados al rojo debido a un mayor contenido policíclico, mientras que los productos refinados muestran espectros más estrechos debido a la reducción de aromáticos pesados, lo que permite la clasificación in situ durante las evaluaciones de derrames.[48] Esta diferenciación apoya los esfuerzos de remediación ambiental al identificar las fuentes de derrames y rastrear la dispersión en ambientes marinos o costeros.

Las aplicaciones de teledetección avanzaron en la década de 1990 con el desarrollo de sondas de fibra óptica acopladas a espectrofluorómetros para el análisis de la contaminación del suelo in situ, lo que permitió mediciones directas de fluorescencia sin extracción del suelo.[49] Estas sondas, a menudo equipadas con fuentes de excitación láser, detectan contaminantes fluorescentes como HAP o hidrocarburos de petróleo a profundidades de hasta varios metros, proporcionando datos en tiempo real para la caracterización del sitio y el monitoreo de la limpieza.[50]

En la industria alimentaria, los espectrofluorómetros detectan adulterantes como la melamina en la leche mediante sondas fluorescentes etiquetadas que muestran extinción o mejora al unirse, lo que garantiza la seguridad del producto y el cumplimiento normativo.[51] Por ejemplo, las sondas a base de lantánidos forman complejos con melamina, lo que da como resultado una emisión intensificada en longitudes de onda específicas mensurables mediante espectrofluorometría, con límites de detección inferiores a 1 ppm adecuados para el control de calidad de rutina.[52]

La fabricación farmacéutica emplea espectrofluorómetros para evaluar la pureza mediante la identificación y cuantificación de impurezas fluorescentes en sustancias y formulaciones farmacológicas.[53] Las técnicas implican excitar muestras en longitudes de onda óptimas para monitorear las emisiones de impurezas, como las de aminas genotóxicas como la 2-aminopiridina, lo que garantiza el cumplimiento de los límites de la farmacopea mediante la detección de fluorescencia de alta sensibilidad.[53] La selectividad de este método para fluoróforos aromáticos ayuda en la validación del proceso y las pruebas de liberación de lotes.

Fortalezas

Los espectrofluorómetros ofrecen una sensibilidad excepcional, capaces de detectar fluoróforos en concentraciones tan bajas como 10−1210^{-12}10−12 M, debido a la medición de las señales de fluorescencia emitidas contra un ruido de fondo bajo, generalmente cercano a cero en ausencia de emisión.[54] Esto contrasta marcadamente con las técnicas basadas en absorción, donde la sensibilidad está limitada por la necesidad de diferenciar pequeñas diferencias en la intensidad de la luz transmitida de un fondo brillante, lo que da como resultado que los métodos de fluorescencia sean de 1.000 a 10.000 veces más sensibles que la espectroscopia de absorción UV-Vis regida por la ley de Beer-Lambert.[55]

La técnica proporciona una alta selectividad a través del control preciso de las longitudes de onda de excitación, lo que minimiza la interferencia de especies no fluorescentes o aquellas con perfiles de emisión no coincidentes, lo que permite el análisis específico de analitos específicos en mezclas complejas.[56] Además, la generación de matrices de excitación-emisión (EEM) produce datos espectrales multidimensionales, lo que permite la discriminación de múltiples fluoróforos en función de sus firmas únicas de excitación y emisión, lo que mejora la resolución en muestras con espectros superpuestos.[57]

Como método no destructivo, la espectrofluorometría preserva la integridad de la muestra, lo que permite su reutilización para análisis o experimentos posteriores sin alteración, lo cual es particularmente ventajoso para cantidades valiosas o limitadas de material.[58]

Los espectrofluorómetros demuestran versatilidad en diversos tipos de muestras, incluidos líquidos, sólidos, suspensiones y gases, mediante el uso de accesorios adecuados, como cubetas, soportes frontales o celdas de flujo, ampliando su utilidad en diversos contextos analíticos.[59]

Desafíos y consideraciones

Un desafío importante en la espectrofluorometría es el fotoblanqueo, la degradación irreversible de los fluoróforos debido a la exposición prolongada a la luz de excitación, que reduce la intensidad de la señal con el tiempo y limita la duración de la medición.[60] Este proceso se ve exacerbado por la alta intensidad de la luz y las especies reactivas de oxígeno, lo que lleva a modificaciones covalentes en la estructura del fluoróforo.[61] Las estrategias de mitigación incluyen el uso de intensidades de excitación bajas, minimizar los tiempos de exposición y emplear agentes antivaho o eliminadores de oxígeno para preservar la integridad de la muestra durante el análisis.[62]

Los efectos de filtro interno y externo surgen de la absorción de la luz de excitación o emisión por la propia muestra, distorsionando la intensidad de la fluorescencia y la forma espectral, particularmente en soluciones concentradas donde la absorbancia excede 0,1.[32] El efecto de filtro interno primario ocurre cuando la luz de excitación se reabsorbe antes de llegar a todos los fluoróforos, mientras que el efecto secundario implica la reabsorción de la luz emitida; Los efectos del filtro exterior se derivan de procesos similares en las paredes de la cubeta.[63] Una corrección común para los efectos del filtro interno primario y secundario utiliza la fórmula Fcorr=Fobs×10(Aex+Aem)/2F_{\text{corr}} = F_{\text{obs}} \times 10^{(A_{\text{ex}} + A_{\text{em}})/2}Fcorr​=Fobs​×10(Aex​+Aem​)/2, donde FobsF_{\text{obs}}Fobs​ es la intensidad observada, y AexA_{\text{ex}}Aex​ y AemA_{\text{em}}Aem​ son las absorbancias en las longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente, suponiendo un modelo simple para valores de absorbancia bajos a moderados en una cubeta de 1 cm.[64] Las correcciones precisas requieren la medición simultánea de los espectros de absorbancia y pueden implicar modelos más sofisticados para muestras de alta concentración.[65]

Los artefactos de dispersión, como la dispersión Rayleigh (elástica) y Tyndall (coloidal), introducen ruido de fondo que se superpone con las señales de fluorescencia, especialmente en muestras turbias o de partículas, lo que reduce la sensibilidad y la precisión. Estos efectos son prominentes cuando las longitudes de onda de emisión están cercanas a las longitudes de onda de excitación, ya que la luz dispersada sigue el mismo perfil espectral.[66] La reducción se logra mediante la geometría de detección estándar de 90 grados, que minimiza la dispersión directa del haz de excitación, combinada con filtros de corte o polarizadores para suprimir la luz no deseada.

La deriva del instrumento, a menudo causada por el envejecimiento de la lámpara en fuentes de xenón o deuterio, produce variaciones en la intensidad de excitación y la salida espectral a lo largo del tiempo, comprometiendo la reproducibilidad entre las mediciones.[67] Esta deriva puede alterar la fluorescencia inicial hasta en varios porcentajes por hora sin intervención.[68] La calibración diaria utilizando estándares estables como el sulfato de quinina en ácido sulfúrico es esencial para normalizar la intensidad y corregir estas inestabilidades, asegurando la trazabilidad hasta las referencias primarias.[69]

Los desafíos modernos en espectrofluorometría incluyen el manejo de nanomateriales como los puntos cuánticos, que surgieron de manera prominente después del año 2000 por sus propiedades de emisión sintonizables pero que presentan problemas como el fotoparpadeo (fluorescencia intermitente debido a la captura de carga) y la polidispersidad del tamaño que afecta la uniformidad espectral. Estas propiedades complican el análisis cuantitativo en medios complejos y requieren protocolos especializados para la estabilización y caracterización.[71]

Para analizar mezclas complejas con espectros superpuestos, las mejores prácticas implican software de deconvolución espectral que emplea métodos multivariados como desmezcla lineal o análisis de componentes principales para resolver las contribuciones de fluoróforos individuales sin separación previa.[72] Herramientas como las basadas en la factorización de matrices no negativas permiten una identificación precisa de los componentes mediante el modelado de matrices de excitación-emisión, lo que mejora la resolución en muestras biológicas o ambientales.[73]