Componentes principales
Los componentes centrales de un espectrofluorómetro forman la vía óptica y electrónica fundamental para excitar una muestra con longitudes de onda seleccionadas y detectar la emisión de fluorescencia resultante. Estos incluyen la fuente de luz, los monocromadores de excitación y emisión, el compartimento de muestras y el detector, dispuestos en una geometría de formato L donde la detección de la emisión se produce en un ángulo de 90 grados con respecto al haz de excitación para minimizar la interferencia de la luz dispersa.
La fuente de luz proporciona la iluminación de banda ancha necesaria para excitar los fluoróforos en un amplio rango espectral. Las lámparas de arco de xenón de alta intensidad son la opción estándar y ofrecen un espectro continuo de aproximadamente 200 a 2000 nm con potencias de salida que generalmente oscilan entre 150 y 1000 W, lo que permite una excitación versátil para diversas muestras. Para aplicaciones que requieren excitación precisa o monocromática, los láseres como los de diodo o los modelos sintonizables pueden reemplazar las lámparas de xenón, aunque limitan el rango espectral.[12]
El monocromador de excitación selecciona la longitud de onda deseada de la fuente de luz para la iluminación de la muestra. Este sistema basado en rejillas, que a menudo emplea un diseño de Czerny-Turner con rejillas de difracción planas, dispersa la luz de banda ancha y utiliza rendijas ajustables para controlar el ancho de banda espectral, generalmente de 1 a 20 nm, equilibrando la resolución y la intensidad de la señal.
En el compartimento de la muestra, la muestra excitada se aloja en una cubeta de cuarzo para garantizar la transparencia en el rango UV-visible, evitando las pérdidas por absorción que se producirían con el vidrio. La geometría de ángulo recto coloca la cubeta de manera que el haz de excitación ingresa a una cara mientras que la emisión se recoge perpendicularmente desde una cara adyacente, aprovechando el desplazamiento de Stokes donde la luz emitida tiene longitudes de onda más largas que la excitación para reducir la superposición.
El monocromador de emisión aísla la señal de fluorescencia de la luz dispersa o de fondo posterior a la muestra. De construcción similar al monocromador de excitación, escanea longitudes de onda más largas, pero puede incorporar un diseño de doble rejilla para lograr niveles de rechazo de luz parásita tan bajos como 10^{-8}, lo que mejora la sensibilidad para emisiones débiles.[15][16]
El detector convierte los fotones emitidos en una señal eléctrica para su análisis. Los tubos fotomultiplicadores (PMT) se utilizan predominantemente debido a su alta sensibilidad, que proporciona una ganancia interna de hasta 10 ^ 6 mediante la multiplicación de electrones, lo que amplifica eficazmente las señales de fluorescencia de bajo nivel. Los dispositivos de carga acoplada (CCD) sirven como alternativas para la detección basada en matrices, ofreciendo lectura simultánea de múltiples longitudes de onda pero con menor ganancia en comparación con los PMT.[17][18]
Componentes auxiliares
Los componentes auxiliares de un espectrofluorómetro mejoran la precisión, la estabilidad y la adaptabilidad de las mediciones al abordar el ruido, las influencias ambientales y el manejo de datos más allá de los elementos ópticos primarios. Estos incluyen dispositivos para modulación de señales, filtrado selectivo de luz, regulación térmica, procesamiento digital e interfaces de muestreo especializadas.
Un helicóptero o modulador actúa como un dispositivo mecánico o electroóptico que alterna el haz de luz de excitación para minimizar el ruido de fondo mediante técnicas de amplificación de bloqueo, que normalmente funcionan a frecuencias entre 10 y 100 Hz.[19] En los espectrómetros de fluorescencia, esta modulación suprime la luz parásita y la corriente oscura del detector, lo que permite la detección de señales de emisión débiles con relaciones señal-ruido mejoradas.[20]
Los filtros aumentan la selectividad en las mediciones; Los filtros de polarización, a menudo colocados antes de la muestra y el detector, facilitan las evaluaciones de anisotropía mediante el análisis de la difusión rotacional de fluoróforos bajo excitación polarizada.[21] Mientras tanto, los filtros de interferencia bloquean eficazmente la dispersión de Rayleigh (dispersión de luz elástica en la longitud de onda de excitación) mientras transmiten la fluorescencia de longitud de onda más larga, logrando densidades ópticas superiores a 10^5 para el rechazo de la luz parásita.[22]
Los sistemas de control de temperatura, como los refrigeradores Peltier o los baños circulantes integrados en los soportes de muestras, mantienen una estabilidad térmica precisa (por ejemplo, de 4 °C a 60 °C), esencial para los fluoróforos sensibles a la temperatura cuyos rendimientos cuánticos y vidas útiles varían con el calor.[23] Estos elementos termoeléctricos permiten un equilibrio rápido y una rampa automatizada, evitando distorsiones espectrales debidas a fluctuaciones térmicas.[24]
El sistema de adquisición de datos incorpora convertidores analógicos a digitales (ADC) para digitalizar las salidas de los detectores, a menudo con una resolución de 16 bits, junto con software para la corrección espectral en tiempo real para tener en cuenta las variaciones en la intensidad de la lámpara en las longitudes de onda.[25] Este procesamiento garantiza la precisión cuantitativa de los perfiles de emisiones, compensando las inestabilidades de la fuente sin intervención manual.[26]
Para mayor versatilidad con muestras no líquidas, las esferas integradoras permiten una iluminación uniforme y la recolección de fluorescencia de sólidos, una técnica perfeccionada en las décadas de 1970 y 1980 para el análisis de emisiones y reflectancia difusa.[27] De manera similar, las sondas de fibra óptica, desarrolladas durante la misma época, apoyan la detección remota transmitiendo excitación y emisión de luz a sitios inaccesibles, como entornos in vivo o industriales.[28] Los sistemas modernos suelen incluir cambiadores de muestras automatizados, lo que permite la detección de alto rendimiento de múltiples cubetas o microplacas para acelerar los ensayos biomédicos.[29]