Un quimiostato es un sistema de cultivo en continuo; su operación esquemática es como la que muestra la figura.

Una operación en continuo exige una serie de consideraciones para modelar su comportamiento:.

Mezcla perfecta (sin gradientes de concentración y con agitación turbulenta);.

Flujo de entrada y salida iguales (F1 = F2 = F);.

Volumen de operación constante (volumen de líquido dentro del biorreactor: dV/dt = 0);.

Parámetros constantes de transferencia (temperatura, pH, velocidad de transferencia de oxígeno, etc.).

La operación industrial de un quimioestáto se ilustra en la figura.

Para iniciar un cultivo continuo; el biorreactor o el fermentado debe cargarse previamente con el inóculo del cultivo y luego de que este crece lo suficiente, alimentar el sistema con medio fresco a un caudal F1 y lavar el producto por un rebalse a un caudal F2, de modo que, el volumen se mantenga constante, el tiempo que dure el bioproceso o la fermentación. El caudal de salida F contiene células vivas (X), medio de cultivo con algún sustrato (S) parcialmente agotado (So) y posiblemente algún producto (P). Al alimentar con medio fresco (So) el caudal de entrada (F1), la biomasa (Xo) y el producto (Po) serán iguales a cero para las condiciones de entrada; por lo que, solo se deberá considerar la concentración de sustrato limitante del crecimiento (So) en la alimentación.

Balances y ecuaciones en el estado estacionario.

Teniendo en cuenta estas consideraciones, los balances de materia para X, S y P en el estado estacionario (E.E) serán:.

Balance de biomasa: VdX/dt = -FX + Vrx = –(F/V)X + µX = 0; rX = mX; E.E » dX/dt = 0. Por definición D = velocidad de dilución = F/V » µ = D.

Balance de sustrato: VdS/dt = F (So – S) – Vrs; rs = µX / YX/S; E.E » dS/dt = 0. Por definición: SEE = KsD / µm – D » XEE = YX/S (S0 – S).

Donde: D = velocidad de dilución; SEE = concentración del sustrato limitante de la velocidad en estado estacionario; XEE = concentración de biomasa en estado estacionario.

Balance de producto: VdP/dt = -FP + Vrp = PEE = qPX / D; rP = qPX; E.E » dP/dt = 0.

Donde: PEE = concentración del producto en el estado estacionario.

Nota: cuando el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento (S) es también la fuente de carbono: X = DY´X/S (So – SEE) / (D + msY´X/S).

Modelo cinético de Monod para el cultivo continuo

El modelo de crecimiento que se aplica en los sistemas de cultivo continuo es el modelo cinético de Monod: D = µmS / (KS + S) » S = KSD / (µm – D) » X = YX/S [S0 – KSD / (µm – D)].

Velocidad Crítica de Dilución: existe un valor de dilución por encima del cual es X = 0; es decir, se produce lavado o arrastre de la biomasa por encima del valor de equilibrio que permite el estado estacionario y F2 > F1.

Este factor se conoce como dilución crítica (Dc); Dc = µmSo / Ks + So.

En condiciones normales de operación continua S0 >> KS » DC = µm por lo que, un quimioestáto debe trabajar a una fracción de µm. En términos de crecimiento de la biomasa esto significa que el quimioestáto impone una condición selectiva al crecimiento del cultivo o el microorganismo.

Formación de producto: PEE = rp/D = qPXEE/D.

Determinación de Parámetros de Crecimiento: un cultivo continuo es sumamente útil para determinar parámetros de crecimiento.

1/D = 1/µm + Ks/µm * 1/SEE.

Se grafica 1/D en función de 1/S los puntos se ajustan a una recta cuya intersección con el eje 1/D es el valor de 1/µm y cuya pendiente es Ks /µm.

D (So – SEE) / XEE = D / Y´X/S + ms.

La gráfica de D (So-S) / X en función de D permite estimar 1/Y'x/s y µs cuando el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento es la fuente de carbono.

La ecuación de diseño nos da el tiempo de residencia (t) del cultivo dentro del biorreactor.

Para poder utilizar la ecuación de diseño hay que modificar la definición de componente X y sustituirlo por conversión X del componente i.

Por definición: Xi = Nio – Ni / Nio Donde: N = moles del componente i. Despejando: Ni = Nio (1 - Xi) » dNi/dt = -Nio dXi/dt = riV Con lo que, la ecuación de balance de biomasa para el estado estacionario se transforma en: -FXi + riV = VdXi/dt = 0.

Reordenado: V/F = ∆Xi / -ri = t = ecuación de diseño de un reactor de mezcla perfecta. Donde: t = tiempo de residencia del cultivo dentro del biorreactor; ∆Xi = Xi2 – Xi1 = dXi.

Otro término comúnmente utilizado en el diseño de reactores es el tiempo espacial (τ) el cual define el tiempo necesario para procesar o fermentar en el biorreactor, un volumen de alimentación, medido en condiciones de entrada (presión y temperatura), igual al volumen de operación del biorreactor (el que define el estado estacionario). El tiempo espacial se obtiene dividiendo el volumen de reactor (V) entre el caudal volumétrico de entrada al biorreactor (Q): τ = V/Q.

Observe que al igual que t las unidades de τ son s-1.

Un cultivo semicontinuo posee una línea de entrada o alimentación (F1). Para iniciar un cultivo alimentado (fed-batch) son válidas las mismas consideraciones que se hicieron para el cultivo continuo; pero, se inicia la alimentación del cultivo cuando el sustrato limitante de la velocidad se ha agotado; esto permite controlar la velocidad de crecimiento, regulando la velocidad de alimentación (caudal); finalmente se debe alimentar el cultivo con medio fresco.

Los balances de materia respectivos para X, S y P son:.

Nota: en estos casos el volumen V permanece dentro del operador diferencial; esto se debe a que varía con el tiempo.

Si en la ecuación de balance de sustrato la velocidad rs se reemplaza por rx / Yx/s se tiene: d (VS)/dt = FSo – 1/Yx/s. d (XV)/dt.

Para controlar la velocidad de crecimiento (rx) mediante el caudal de alimentación (F) el sustrato (S) debe ser cero en todo momento: S = 0 y por lo tanto: d (SV)/dt = 0. Esta condición equivale a que el sustrato sea consumido en su totalidad conforme ingresa al biorreactor; es por eso que se aplica la condición de alimentación fresca. Bajo estas condiciones, la ecuación de balance de biomasa se transforma en: d (VX)/dt = FSoYx/s y por integración: XV = XeVe + FSoYx/st Donde: Xe y Ve representan la concentración de biomasa y el volumen de cultivo al iniciar la alimentación.

La variación del volumen con el tiempo es: V = Ve + Ft.

El criterio para diseñar una alimentación adecuada se obtiene por la ecuación: FSo = VeµXe / Yx/s la ecuación es válida para cualquier rango de µ, hasta µm.

Como criterio adicional, sobre todo en procesos de fermentación se suele seleccionar un valor de So tan alto como sea posible y lo contrario con F (uno relativamente pequeño); a fin de evitar el lavado del cultivo por dilución excesiva. No obstante esto ocasionaría que la duración del cultivo (tiempo de fermentación) se prolongarse excesivamente. Para buscar el equilibrio se diseñó empíricamente una solución de compromiso: µ = 1 / VX. d (VX)/dt = Yx/sFSo / XeVe + Yx/sFSot.

Ecuación de diseño de un biorreactor semicontinuo ideal

Un sistema de cultivo semicontinuo es un sistema transciende; es decir, hay un flujo temporal o transitorio que alimenta o drena (lava) el sistema. El balance general de masa que se aplica a un volumen de control (diferencial de volumen) para un componente i en un sistema de flujo semicontinuo es:.

Entra - Sale - Desaparece = Acumula ―› Fi - (Fi+dFi) - (-rxi) dV = 0.

Operando se obtiene: - dFi = (-rxi) dV Por definición la conversión del componente i en reactores en flujo (semicontinuo) es: Xi = Fio – Fi / Fio por lo que, sustituyendo en la ecuación de balance: FiodXi = -rxidV Integrando la expresión anterior: ∫ dV/Fio = ∫ dXi/-rxi donde los límites de integración son: 0, V para el volumen y Xio, Xif para la conversión. Resolviendo la integral obtenemos: V/Fio = ∫ dXi/-rxi = t la ecuación de diseño para un biorreactor de flujo (semicontinuo). La ecuación es válida tanto si existe o no variación de caudal (flujo) del sistema. Cuando se requiere una expresión en función de la concentración, podemos utilizar la siguiente ecuación: Fio = CioQi donde Cio es la concentración del componente i en las condiciones de entrada y Qi es el caudal volumétrico del componente i. Sustituyendo: V/Fio = V/QiCio = τ/Cio donde τ es el tiempo espacial del biorreactor. En forma integral: τ = Cio ∫ dXi/-rxi

Para sistemas de densidad constante: τ = - ∫ dCi/-rxi.

Nota: al comparar la ecuación de diseño de un biorreactor semicontinuo ideal con la que se obtiene para uno discontinuo ideal, se observa que la diferencia está la expresión que toma el tiempo: t o t. En un biorreactor discontinuo, t representa el tiempo de cultivo tc y es igual a la duración del bioproceso o la fermentación; lo que equivale a decir, el tiempo necesario para que el sustrato limitante de la velocidad se agote. En un biorreactor semicontinuo (de flujo) el tiempo t corresponde al equivalente para que la conversión de salida alcance su máximo valor posible; es decir, para que la generación de biomasa o bien, del componente metabólico X, alcancen su máximo de crecimiento (µm) para un mismo componente i. Es por eso que en un biorreactor de flujo el tiempo t se llama también tiempo de residencia tr; ya que, es el tiempo que el cultivo reside dentro del biorreactor; el cual es diferente (mayor) del tiempo de cultivo tc, puesto que aún después de agotado el sustrato limitante de la velocidad, el cultivo (células o microorganismos) tiene la capacidad metabólica de seguir sintetizando metabolitos X o generar más biomasa (crecer); es por eso que le incorporan los adjetivos “limitante de la velocidad” al sustrato S.

Una sistema de cultivo discontinuo no posee alimentación (F1) o lavado (F2); se carga el contenido del biorreactor (tanda o lote) con el medio de cultivo y luego se inocula con el cultivo (células o microorganismos) y se deja crecer hasta obtener el producto (biomasa o metabolito).

Dado que F1 = F2 = 0, las ecuaciones de balance son:.

Generación de biomasa: cuando la operación discontinua tiene como objetivo la generación de biomasa (células o microorganismos); se parte del supuesto de que no se forma producto y que la relación µ-S puede ser representada por la ecuación de Monod, con lo que las ecuaciones de balance de biomasa y balance de sustrato limitante de la velocidad quedan:.

El sistema de ecuaciones posee solución analítica, pero en esta, no aparece X en forma explícita, por lo que, resulta de poca utilidad. Afortunadamente, es posible analizar casos particulares, haciendo algunas suposiciones. En el caso de tomar en cuenta únicamente la fase exponencial del crecimiento, cumple que: S » Ks y las ecuaciones se reducen a las originales, salvo que µ es substituida por µm:.

Dado que bajo tales condiciones el crecimiento ocurre al máximo valor de posible, integrando la ecuación de balance de biomasa con las condiciones: t = 0, X = Xo se obtiene una expresión para la concentración de biomasa en función del tiempo: X = Xo eˆµmt o bien: lnX = lnXo + µmt.

La ecuación establece que para S » Ks, el crecimiento es exponencial y permite calcular el valor de µm graficando el valor del logaritmo de X (ln X) en función del tiempo (t).

En forma similar, la concentración de sustrato limitante de la velocidad en función del tiempo es: S = So – [(Xo / Yx/s) (eˆµmt - 1)].

Conforme el sustrato se agota, S disminuye y la condición de S se hace comparable a Ks con lo que dX/dt comienza a disminuir (fase de desaceleración), hasta hacerse finalmente nula (S = 0); en este punto, se alcanza la máxima concentración de biomasa y finaliza el cultivo, pues se ha alcanzado la fase estacionaria.

La concentración final de biomasa (Xf) se puede calcular si se conoce Yx/s:.

Yx/s = - (Xf – Xo) / (Sf – So) Dado que Sf = 0, Xf = Xo + Yx/sSo

Lo usual es utilizar estas ecuaciones para calcular Yx/s.

En la figura se ilustran las distintas fases de crecimiento descriptas, que surgen de la ecuación de Monod. Note que antes de la fase exponencial existe una fase de retardo durante la cual, la concentración de biomasa no se modifica substancialmente pero, ocurren cambios en la composición macromolecular y en el "estado fisiológico" de las células del cultivo. Si por algún motivo debe tomarse en cuenta esta fase, se debe aplicar una corrección a la ecuación la concentración de biomasa en función del tiempo: lnX = lnXo + µm (t – tr) donde tr es el tiempo de retardo; es decir, la modificación consiste en restarle al tiempo real, el tiempo transcurrido hasta que comienza el crecimiento exponencial. Normalmente, la fase de retardo no es deseable, tanto por la pérdida económica como por el tiempo desperdiciado; para minimizarla se hace crecer el inóculo aparte, en un medio de cultivo igual al que se va a emplear en el bioproceso (cultivo o fermentación) y luego se procede a transferirlo cuando las células ya se encuentran en la fase exponencial. La última fase es la decaimiento o muerte y consiste en la disminución de la concentración celular de la biomasa por lisis o muerte celular.

Ecuación de diseño de un biorreactor discontinuo ideal

Un sistema de cultivo discontinuo es un sistema discreto en cuanto al movimiento de biomasa, ya que no hay flujos. Como condiciones de idealización en un biorreactor discontinuo ideal se supone que el cultivo y su medio están perfectamente agitados y que los parámetros de velocidad (r) son constantes en todo el volumen del sistema (volumen de control); es decir, que la mezcla es perfecta. La otra consideración es que se trabaja con velocidades y componentes individuales (i), por lo que se utiliza la definición de conversión del componente i (Xi), en vez de biomasa; es decir, se trabaja el componente metabólico, no la célula.

La ecuación de balance del componente i es: d (Xi)/dt = rxi = µXi.

Teniendo en cuenta la definición de conversión y diferenciando Ni respecto al tiempo: dNi/dt = -NiodXi/dt.

Sustituyendo en la ecuación de balance: -NiodXi/dt = rxiV.

Separando en variables e integrando: ∫ (Nio/-rxiV) dXi = ∫ dt donde los límites de integración son: Xio (conversión de entrada) y Xf (conversión final) para la conversión y to = 0 (tiempo inicial) y tf (tiempo total de reacción) para el tiempo de reacción.

Integrando obtenemos: t = Nio ∫ dXi/-rxiV la ecuación general de diseño para un biorreactor discontinuo ideal.

Un biorreactor con aireación es por definición un reactor continuo donde la entrada F1 es una línea de alimentación de aire estéril (O); la salida F2 es una línea de lavado de aire estéril y el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento es el oxígeno disuelto (OD).

Existen dos tipos o diseños básicos de biorreactores con aireación; ambos, de uso muy difundido: el primero es tanque agitado con línea de aireación y el segundo es el de levantamiento por aire o "air lift". De este último existe también, una variante que se utiliza para cultivos aeróbicos muy resistentes a esfuerzos cortantes e hidrodinámicos y es la cama de burbujas o “bubble bed”.

Estructura de un reactor continuo de tanque agitado con línea de aireación

Un CSTR con línea de aireación es utilizado, por lo general, como dispositivo fermentador para células y cultivos aeróbicos; su esquema se representa en la figura. En él, la aireación se da en régimen laminar o de transición (Re≤3000) por cuanto estas fermentaciones son destinadas a cultivos de células y microorganismos aeróbicos “sensibles” a esfuerzos cortantes e hidrodinámicos altos. La agitación “extra” requerida se realiza mecánicamente, por medio de: un eje transmisor de potencia provisto de aletas o turbinas de agitación y accionado por un motor de corriente alterna con control de potencia y velocidad.

Además de esto, es indispensable que el sello mecánico del eje del motor sea hermético y esterilizable; que las líneas de entrada y salida de aire sean estériles y que la difusión del aire dentro del biorreactor sea controlada en presión, flujo y concentración. Para completar el esquema de diseño: el aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es difundido a través de toda la mezcla por una corona con pequeños orificios espaciados regularmente o una boquilla de difusión. La “cama” de aire debe ser un “chorro” de finas burbujas de aire de pequeño diámetro, que salen de cada orificio de la corona o el difusor (boquilla) y al ser "golpeadas" por las paletas de la turbina o el agitador, se distribuyen por todo el volumen, generándose miles de pequeñas burbujas de aire que, difunden el O disuelto hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o seis deflectores o “baffles” que rompen el movimiento circular que imprimen las paletas de la turbina o el agitador al líquido y generan mayor turbulencia y mejor mezclado; pero sin dañar el tejido o la pared celular de las células y microorganismos (tamaño de Kolmogorov de los Eddies). Finalmente, el tanque debe poseer un intercambiador de calor formado por una camisa por la que circule agua, para poder controlar la temperatura del cultivo y evitar que este muera o sufra un estrés térmico.

Estructura de un biorreactor de levantamiento por aire

Cuando el volumen es muy grande (mayor que 1000 l) o se requiere de un mayor volumen de aireación, el sistema CSTR, ya no es eficiente y se requiere del levantamiento por aire. Debido a que, a mayor volumen de cultivo, también es mayor la cantidad de calor generado; se hace necesario, aumentar el área de transferencia de calor y la eficiencia de refrigeración; por lo que, el intercambiador de calor de camisa debe ser reemplazado por uno de serpentín en contra flujo o con circulación adyacente a la pared interior del tanque. Ver esquema representado en la figura.

Al igual que en el diseño de tanque agitado, el aire que ingresa al biorreactor debe ser estéril; esto se consigue, haciéndolo pasar por un filtro microporo de diámetro de poro inferior a los 0,45 micrones (0,2 µm – 0,1 µm) que impida el paso de microorganismos contaminantes. En los biorreactores de levantamiento por aire o "air lift" la cama de aire también funciona como medio de agitación; de modo que, se genere una circulación fluida de líquido con aire (burbujas) que asciende el compartimiento interno y luego desciende por el compartimiento externo, favoreciendo el mezclado perfecto.

Transferencia de O2 y balance de oxígeno

La velocidad de transferencia de 02 (r02) desde el seno de la fase gaseosa (burbujas) hasta la fase líquida (medio líquido) está determinada por la siguiente ecuación: rO = Kla (C*- C) donde KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno; C la concentración de 02 disuelto en el seno del líquido y C* la concentración de O disuelto en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase gaseosa. El KLa y por lo tanto el grado de transferencia de oxígeno desde el seno del líquido hasta las células o microorganismos en cultivo, dependen del diseño del biorreactor y de las condiciones de operación del sistema de cultivo: caudal de aire, volumen del líquido, régimen de agitación, área de transferencia y viscosidad del cultivo. En general, disminuyen el KLa: la viscosidad y el volumen del líquido y aumentan el KLa: el área de transferencia, la agitación y la presencia de dispositivos que aumenten una, la otra, o ambas.

La ecuación de balance de oxígeno en el estado estacionario es: d(VCO) / dt = F (C – C*) – VrO + VNiO donde Ni es la velocidad de transferencia de un componente del gas (oxígeno) al líquido (medio). Dado que el oxígeno es el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento, cuando el cultivo se encuentra en crecimiento, el flujo de entrada oxígeno (FiO) será mayor al flujo de salida de oxígeno (FfO) debido al consumo de oxígeno disuelto en el líquido por parte de las células o microorganismos en crecimiento y/o división celular.

En este caso, la ecuación de balance de oxígeno para células o microorganismos en crecimiento es: d(VCO) = FiOC – FfOC* – VrO + VNiO es decir, debe utilizarse la ecuación general.

Sistema de aireación

El sistema de aireación externamente comprende las líneas de entrada Fi y salida de aire Ff e internamente debe optimizar la transferencia de gases nutrientes (aire) hacia el medio líquido. Un sistema de aireación consta de cuatro partes mecánicas: fuente de aire; tubería y filtros de entrada; boquilla y difusor de aire; tubería y filtros de salida. Y tres partes de control: control de flujo aire; control de presión de aire; control de difusión de oxígeno disuelto.

Fuente de aire: dado que el sistema de aireación, en su conjunto, depende de la correcta elección del dispositivo que suministrará la fuente de aire, se siguieren dos opciones:.

a) El compresor de diafragma: está diseñado para un trabajo de operación continua; su presión operación es moderada ≈ 60 psia y como su nombre lo indica, utiliza un diafragma o fuelle para impulsar y comprimir el aire. El compresor de diafragma resulta adecuado para oxigenar volúmenes medianos de cultivos o microorganismos aeróbicos.

b) El compresor de pistón: es más utilizado comercialmente, no obstante, para cultivos celulares sensibles (células de membrana plasmática), no es recomendable, por cuanto, su presión de operación es muy alta (80 psia o más) para estos cultivos y puede causar daño celular severo o la lisis de las células; y porque, el pistón debe lubricarse con aceite y esto ocasiona que se filtre en pequeñas cantidades a la corriente de aire.

Tubería - Línea de aire: esta debe ser de acero inoxidable.

Filtros de las líneas de aire: para sistemas pequeños de diámetros de tubería estándar, se utilizan filtros en línea con la tubería; estos son de membrana microporo que filtran el 99,99% de los contaminantes. Para sistemas mayores (industriales) debe diseñarse un método de esterilizar in situ la línea de aire; generalmente se hace calentando fuertemente la línea de aire y luego enfriarla. Las membranas microporo que filtran el aire tienen un punto de burbuja que es la presión de agua máxima que pueden soportan antes de romperse (recuerde que el sistema tiene un medio líquido) y un flujo máximo el cual es el máximo caudal que puede soportar la membrana antes de su ruptura.

Sistema de difusión de oxígeno disuelto: debe optimizar al máximo la transferencia de oxígeno disuelto al medio líquido. El sistema consta de dos partes mecánicas: boquilla y difusor de aire; una parte de medición: sensor de oxígeno disuelto y una de control: controlador de oxígeno disuelto.

Difusor de aire: los cultivos aeróbicos requieren que la corriente de aire estéril que se difunda en la forma de miles de pequeñas burbujas, desde el difusor de aire, hacia el volumen del líquido; esta acción se realiza mediante un plato o domo cilíndrico de acero inoxidable finamente perforado. Alternativamente y si el sistema es pequeño o mediano en escala, se puede utilizar un difusor de material cerámico poroso el cual, tiene la ventaja de que, provee una cama más fina de burbujas (de menor diámetro) y mayor área de transferencia (volumen de burbujas).

Los cultivos anaeróbicos y facultativos están constituidos por células y microorganismos cuyo metabolismo ante la ausencia de oxígeno, utiliza vías metabólicas alternas para la oxidación de los compuestos que le sirven de nutrientes. En estas células y microorganismos, la respiración celular se sustituye por una ruta oxidativa alterna llamada fermentación en la que, el piruvato no produce CO como producto final de desecho; por el contrario, se consume CO y esta es incorporado, junto al piruvato, en la fermentación, cuyo producto final de desecho, le da nombre; por ejemplo: en la fermentación alcohólica el piruvato se oxida a acetaldehído y al final de la cadena oxidativa se produce etanol como producto final de desecho.

Un fermentador es un dispositivo de tipo tanque agitado en el que se realiza una fermentación controlada. Los fermentadores suelen operar en modo semicontinuo; por cuanto, debe alimentarse una línea de sustrato limitante de la velocidad de crecimiento (S) para mantener el crecimiento celular o microbial durante la fermentación.

El catabolismo celular de las fermentaciones además del producto final, produce gran cantidad de subproductos de desecho y metabolitos secundarios que son excretados al medio de cultivo, por las células en cultivo, y esto genera gran cantidad de espuma en el caldo de fermentación. Las espumas modifican la acidez del medio de cultivo ya que, cambian el pH del medio de cultivo y por tanto, debe regularse y controlarse la acidez del medio adecuadamente. Medir y controlar el pH es un aspecto muy importante de los bioprocesos, ya que los cambios en el pH pueden alterar significativamente las condiciones de crecimiento, generalmente con consecuencias importantes. Los medios de cultivo suelen incluir tampones, es decir, sustancias que mitigan los cambios de pH demasiado repentinos causados por la adición de un ácido o una base. Debido a que un goteo de ácido en el medio de cultivo puede dañar muchas líneas celulares, los científicos a menudo enriquecen cuidadosamente la mezcla de gas utilizada en el cultivo celular con CO2 en lugar de agregar un ácido líquido. Luego, el gas se disuelve en el medio de cultivo, lo que permite que el dióxido de carbono influya en el pH en combinación con un tampón.[8]​ Adicionalmente, la turbidez y la cantidad de espuma, deben mantenerse en niveles adecuados para evitar pérdidas y el mal funcionamiento del biorreactor.[9]​ Finalmente, la mayoría de los procesos fermentativos generan gran cantidad de calor debido a la naturaleza exergónica del catabolismo celular de estos microorganismos, por lo que, la temperatura también debe ser controlada.

En la mayoría de los cultivos anaeróbicos el dióxido de carbono (CO) es el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento por lo que, la cinética del sistema de cultivo debe modificarse incorporando la ecuación de balance de consumo de CO: d(VCCO)/dt = FiCCOi – FoCCOo + VrgCO – VNoCO

Donde: CCO = concentración de CO en el líquido; rg = velocidad de generación; No = velocidad de transferencia de un componente del líquido al gas; i = ingreso; o = salida.

Control y Medición del CO Disuelto (COD): la curva de generación de CO se debe determinar experimentalmente para determinar la velocidad de consumo de sustrato limitante de la velocidad (rgCO) del cultivo; para eso, es necesario mantener el crecimiento máximo del cultivo.

En la práctica la curva de consumo de CO se determina basándola en la concentración de dióxido de carbono disuelto (COD) en el medio de cultivo; esta puede ser medida y controlada con un dispositivo comercial diseñado para ese propósito, un controlador COD y la sonda o probeta COD respectiva.

El suministro de CO se obtiene con un cilindro de CO recargable.

La regulación del flujo de CO se realiza manualmente con un regulador manual de flujo o manómetro; se debe hacer de forma que, se mantenga la concentración máxima de dióxido de carbono disuelto, medida en el controlador COD, para que, la velocidad específica de consumo de sustrato para mantenimiento (m) se mantenga en todo momento.

El control de flujo de CO se realiza utilizando una válvula solenoide electrónica que el controlador COD dirige al recibir la señal de la probeta COD y sobre la base de su valor, comanda la apertura o clausura de una válvula solenoide, mediante una señal de paso (abrir o cerrar) que regula el flujo de CO proveniente del tanque de CO comprimido. Las válvulas solenoides son servo mecanismos eléctricamente controlados y se escogen de acuerdo al material, al número de vías, al calibre y la presión y si permanecen abiertas o cerradas, entre otros.

La difusión del CO en el medio líquido se realiza utilizando una boquilla de difusión o un difusor de gases de material cerámico poroso.

Sistema de Control de Espuma

La presencia de oxígeno en el ambiente interno del biorreactor ocasiona que los productos de desecho del catabolismo celular de los microorganismos facultativos, sean oxidados, por lo que, las espumas se tornan densas y “jabonosas” ocasionando serios problemas funcionales y contaminado el cultivo.

Un sistema de control de espuma (ver diagrama) consta de dos subsistemas sistemas que funcionan en conjunto:.

El frasco dispensador es factor común en ambos subsistemas.

La bomba peristáltica “maja” la manguera flexible e impulsa el flujo del fluido antiespumante dentro del biorreactor.

La manguera flexible se escoge según el material, el tipo de bomba y la longitud; se recomienda una de silicón curado o Tygon y para un sistema de bombeo L/S (bomba sencilla de velocidad fija o variable).

Nota: la manguera flexible se conecta al sistema (biorreactor) mediante un tubo de adición de reactivo.

Este debe ser de acero inoxidable y su diámetro (puerto) debe ser el diámetro interno de la manguera flexible.

El sistema controla el pH del medio de cultivo; que es generada por los productos de desecho y el metabolismo propio del cultivo celular o microorganismos. Un sistema de control de acidez consta de:.

Dos subsistemas mecánicos servo controlados.

Nota: recuerde que las mangueras flexibles se deben conectar al sistema (biorreactor) mediante un tubo de adición de reactivo para cada una de ellas.

Un sistema de control formado por:.

Un sistema de medición: formado por:.

Al crecer los microorganismos en ambientes naturales, su rango de pH se acerca a los valores del hábitat en que se desarrolla; el rango normal de acidez en que pueden sobrevivir la mayoría de los microorganismos es 2,0 ≥ pH ≤ 10,0.

La mayoría de los hábitats tienen valores de pH de 5,9 por lo que, los microorganismos que viven en esos hábitats tienen un pH óptimo equivalente (5,9).

Algunos rangos de pH óptimo son: para levaduras entre 3,5 y 5,5; para bacterias entre 6,0 y 7,5; para mohos, según la cepa, se extiende entre 3 y 7; para células en cultivo entre 6,0 y 7,5.

La forma exacta de la curva de acidez es muy variada y depende del metabolismo propio de cada microorganismo o célula por lo que, no se ha formulado un modelo general y simple para representarla.

Sistema de control de temperatura

Mantiene estable y dentro de un rango óptimo requerido por el cultivo para su máximo crecimiento, la temperatura interna del sistema.

Un sistema de control de temperatura consta de:.

Dos sistemas de intercambio térmico:.

Un sistema de control:.

Un sistema de medición:.

Un servo control:.

Un sistema regulador de paso de flujo:.

Un sistema de conducción de fluido:.

Nota: las tuberías deben anclarse al cuerpo del biorreactor mediante un puerto de entrada que es soporte hermético que la sujeta a la superficie plana.

Temperatura Óptima: la temperatura es otro factor ambiental que influye y que afecta el crecimiento del cultivo microbiano y celular; poniendo el juego, la propia supervivencia de la célula o microorganismo. La temperatura afecta a las células y microorganismos cultivados de dos formas distintas:.

En este punto analizaremos únicamente el primer ítem; más adelante veremos el segundo.

Para cada célula y microorganismo existe una temperatura mínima por debajo de la cual, no hay crecimiento; es decir se inhibe el crecimiento celular.

Y una temperatura máxima por encima de la cual, la célula o microorganismo muere.

Entre ese rango de temperaturas existe una temperatura óptima para la cual, el crecimiento es el más rápido posible.

Estas tres temperaturas son características de cada célula y microorganismo y pueden variar ligeramente con la composición del medio de cultivo.

Determinación de la Temperatura Óptima de Crecimiento: se realiza desde el punto de vista cinético, aplicando la Ley de Arrhenius para el crecimiento y la muerte de células o microorganismos: dln (k)/dt = Ea/RT2; dln (k) = -(Ea/R)*d(1/T) Donde: k = máx (para el crecimiento), k = máx (para la muerte), T = temperatura absoluta, R = Constante de los gases ideales, Ea = energía de activación del proceso: EC para el crecimiento, Em para la muerte; EC = 8 – 12.000 cal/g-mol K (crecimiento), Em = 50 – 100.000 cal/g-mol K (muerte).

La realización de la curva de crecimiento EC en conjunto a la curva de muerte Em representada por su logaritmo ln (k) versus el inverso del tiempo 1/T conduce a la determinación gráfica de la temperatura óptima.

Componentes de diseño de un biorreactor de tanque agitado

Para lograr el cumplimiento de objetivos descritos, un biorreactor de tipo tanque agitado o CSTR (ver figura), debe contar con los siguientes componentes básicos en su diseño:

figura.

Un sistema de agitación consta de cuatro partes mecánicas:.

Motor Impulsor: suministra la potencia al eje de potencia; debe ser de corriente alterna (a.c), preferiblemente de inducción y su potencia debe calcularse para manejar el doble (200%) de la potencia teórica requerida para agitar el fluido y el cultivo a Re≥3000. Motor de Inducción (A.C): dado que un biorreactor debe operar de forma continua durante todo el proceso de cultivo; se requiere un motor capaz de resistir largos periodos de operación continua y trabajo duro; por eso, el motor debe ser de inducción de corriente alterna (a.c) y debe ser acorazado, preferiblemente en acero inoxidable.

Eje trasmisor de la potencia: es una barra cilíndrica de acero inoxidable 316L y por lo general se diseña en diámetros estándar: ¾”, ½”, etc., para mayor facilidad de ajuste a los estándares de motores a.c. Su longitud depende de la profundidad del contenedor (tanque).

Acople del Eje Transmisor: ajusta y fija al motor, el eje transmisor de potencia. Existen dos tipos de acople:.

Acople-adaptador de tipo taladro: el puerto de entrada se acopla al eje del motor por fijación directa. El puerto de salida es un dispositivo que se adapta a varios diámetros de broca y sujeta o abraza firmemente el eje transmisor de potencia por presión y abrasión; similar al que utilizan los taladros mecánicos.

Acople-ajustador de tipo tornillo-rosca: el puerto de entrada se “enrosca” o se fija firmemente al eje del motor. El puerto de salida es un dispositivo que “abraza” el eje transmisor de potencia por un mecanismo de tornillo-rosca.

En ambos casos, el diámetro del puerto de entrada del acople que es la unión de este con el eje del motor debe ser de diámetro interno igual al diámetro externo del eje del motor y el diámetro del puerto de salida que es dispositivo sujetador del eje transmisor de potencia debe ser el mismo que el diámetro externo del respectivo eje.

Puerto de Entrada del Biorreactor: se denomina puerto a la superficie física sobre el cual se instala un dispositivo de entrada o salida al biorreactor, un anclaje o un aparato mecánico o de medición; el puerto es el medio por el cual, se ajusta o fija, tal dispositivo o artefacto a la pared o superficie del tanque o del biorreactor. Como se observa en la fotografía, el puerto de entrada es la tapa o cara superior del tanque biorreactor y en donde se anclan o sujetan todos los dispositivos y periféricos que se requieren para su operación. Cada dispositivo de anclaje o sujetador también un puerto menor cuyo diámetro externo es la superficie externa total y cuyo diámetro interno es el diámetro externo del dispositivo que sujeta. Algunos puertos tienen dos diámetros internos, cuando el dispositivo que sujetan tiene diámetro externo y diámetro interno; por ejemplo, los sensores o probetas medidores y el sello mecánico del eje del agitador.

Sello Mecánico: su función es triple: evitar la contaminación, mantener hermético el sistema, servir de amortiguador de fricción. El sello mecánico también debe permitir la esterilización in situ del biorreactor, mediante una línea de vapor sobrecalentado. Un sello mecánico, generalmente se diseña en una de dos configuraciones:.

Cartucho rígido: que permite el rodamiento del eje de potencia a través de soporte de cuerpo rígido que sella y aísla el paso de cualquier materia al interior del depósito.

Cartucho flexible: que permite el rodamiento del eje de potencia a través de un soporte fijo al exterior pero flexible en el interior y que también sella y aísla el paso de contaminantes al interior del depósito.

En ambos caso el sello mecánico se especifica de acuerdo al diámetro eterno del eje transmisor de potencia; el cual es el diámetro interno del puerto del sello mecánico. Dentro de lo posible se recomienda el uso de sellos flexibles ya que amortiguan mejor las vibraciones mecánicas del eje transmisor de potencia; la desventaja es que esa flexibilidad obliga a cambiarlos más frecuente, pues el desgaste es mayor.

Eje Transmisor de Potencia: transmite la potencia del motor al impulsor, a través de, las hojas de agitación. Existen ejes en los cuales ya vienen incorporadas hojas o aspas de agitación, se diseñan para operar en uno de dos sistemas de flujo, según sea, la orientación espacial de las hojas o aletas:.

Flujo axial: suministran mayor efectividad de mezclado (distribución) y reducen la potencia de mezclado requerida, al distribuir mejor la mezcla; sus hojas u aspas son planas.

Flujo radial: generan mayor potencia de mezclado (turbulencia) y pueden causar daño celular; sus hojas o aspas son del tipo hélice.

Impulsores: son los dispositivos que impulsan el fluido y el movimiento, mediante hojas o aspas unidas al eje transmisor de potencia; pueden ser del tipo mecánico (agitador) o hidráulico (turbina).

Agitadores: es un impulsor formado por hojas o aspas de agitación conectadas al eje transmisor de potencia; pueden tener una distribución de flujo axial o radial.

Los propulsores de flujo radial pueden tener gran variedad de formas y diseños; dentro de estos, las hélices son las que más se utilizan.

Hélices: existen en tres diseños básicos que dependen de la orientación espacial:.

(a) – Plano XY,.

(b) – Plano ZX,.

(c) – Plano ZY.

Cada orientación (plano) describe una superficie curva que es determinada por dos (2) de tres (3) ángulos de diseño:.

(a) Plano XY, determina el ángulo de inclinación (α), este varía 15’ ≤ α ≤ 45’;.

(b) Plano ZX, determina el ángulo de torsión (β), este varía 16’ ≤ β ≤ 32’;.

(c) Plano ZY, determina el ángulo de tensión (γ), este varía 15’ ≤ γ ≤ 45’.

Como se observa en la figura:.

(a) – Hélices de superficie curva en el Plano XY están determinadas por los ángulos α, β;.

(b) – Hélices de superficie curva en el Plano ZX están determinadas por los ángulos α, γ;.

(c) – Hélices de superficie curva en el Plano ZY están determinadas por los ángulos γ, β.

Por su gran potencia y la turbulencia que generan, las hélices no se recomiendan para cultivos de células sensibles; solo deben utilizarse para cultivos bacteriales o micóticos y a bajas velocidades de rotación.

Turbinas: es un impulsor de flujo axial el cual opera como una centrífuga que distribuye el flujo de líquido a través de hojas planas, a todo el volumen de fluido.

El impulso axial ha demostrado ser la forma más eficiente de diseño para reducir esfuerzos cortantes e hidrodinámicos y disminuir la turbulencia y la potencia requerida para homogeneizar el mezclado; objetivo que se persigue en una mezcla perfecta. Por eso se recomienda impulsores de flujo axial para cultivar células sensibles o de membrana plasmática. Dentro de estas, la turbina Rushton (b) es el impulsor de flujo axial más recomendado y más eficiente para generar una mezcla perfecta de alto perfil hidrodinámico, bajo en esfuerzos cortantes y alto en distribución.

Y una de control:.

Control de Velocidad del Motor: los motores de inducción de corriente alterna (a.c) tienen velocidades nominales de rotación de 1800rpm o 3600rpm. Estas velocidades son muy altas para los sistemas biológicos causando la destrucción de las células y microorganismos en cultivo. La velocidad de rotación del motor debe entonces reducirse a un máximo de 600rpm (revoluciones por minuto) para que no cause daño celular. Usualmente se acopla a la salida de eje del rotor una caja de reducción de 1/3 o 1/6 para bajar la velocidad de rotación a 600rpm. Adicionalmente se coloca un control de velocidad que puede ser analógico o digital al motor para un control más fino y preciso de la velocidad de rotación.

Agitación y Mezclado.

Relaciones de Potencia y Mezclado: conforme el diámetro de la hoja o aspa (Dd) aumenta, también lo hace, la potencia (Pt) requerida para realizar el trabajo de mezclado; la potencia de mezclado (Pm) es mayor porque el torque (τ) se acrecienta, recuerde que el torque es la relación entre la fuerza (F) y el brazo de palanca (r) y que, el brazo de palanca es el diámetro del aspa u hoja cuyo momentum (mv) aumenta al aumentar la velocidad de rotación (ω). Así entonces, cuando Dd es muy grande, debe disminuirse ω para reducir Pt; pero esto ocasiona que Pm también se contraiga; así como la turbulencia excesiva. Caso contrario ocurre cuando Dd es muy pequeño, debe aumentarse ω para mejorar Pm y extender la turbulencia, ya que, en estos casos, es localizada (se acumula alrededor de las aspas y hojas). Este fenómeno local que se conoce como potencia fluida (Pf) provoca que el volumen de líquido que es afectado por la turbulencia local (Rex) no sea suficiente para oxigenar los tejidos y células en cultivo pues el Kla disminuye. Para que la Pf se transmita a todo el volumen de operación del fluido, es necesario que, se alcance el estado estacionario (EE) en dicha operación, y esto toma mucho tiempo lo que implica, un alto costo.

La mejor forma de combinar positivamente estos efectos hidrodinámicos que se contraponen; es decir: bajar Pm y aumentar Pf es optimizar Dd. A esto se le conoce como potencia óptima de mezclado (Pe) y se logra de dos maneras:.

La primera alternativa minimiza la potencia de mezclado requerida y maximiza la potencia fluida al aprovechar mejor el gradiente de mezcla. La segunda aumenta la potencia de mezclado y la potencia fluida pero también, la potencia requerida y desaprovecha el gradiente de mezcla y difusión.

Utilización de Bafles: son una mejora muy utilizada ya que pueden instalarse fácilmente en los sistemas de agitación, disminuyen (deflectan) la turbulencia ocasionada por las hojas o aspas del impulsor, rompen (disgregan) los cúmulos celulares y micelios que se forman en los respectivos cultivos y mejoran la eficiencia de mezclado. La relación óptima del diámetro del bafle (Db o J) al diámetro de tanque (Dt) es: Db/Dt = 1/10–1/12. El número indicado de bafles es 4 para sistemas moderadamente agitados y 6 para sistemas turbulentos.

Sistemas de intercambio térmico

La transferencia de calor es un proceso el que se intercambia energía en forma de calor entre distintos cuerpos o entre diferentes partes de un mismo cuerpo que están a distinta temperatura. El calor se transfiere por una combinación de dos o más de estos tres procesos: convección, conducción o radiación. Uno de los mecanismos térmicos (proceso) suele predominar sobre los otros dos, también es posible que los tres procesos se den simultáneamente. La conducción es el proceso dominante en los intercambiadores de calor de casco y tubos y en el tubo serpentín. Aunque el mecanismo exacto de la conducción no se comprende, se sabe que se debe al movimiento (energía cinética) de los electrones libres que se mueven por la red cristalina del sólido y transportan energía cuando existe una diferencia (gradiente) de temperatura.

Ley de Fourier: J = KδT/δx Donde J = densidad de corriente de energía (J/m²s); K = conductividad térmica (constante característica del material).

La velocidad de conducción de calor (J) a través de un cuerpo sólido (medida por unidad de sección transversal) es proporcional directamente al negativo del gradiente de temperatura que existe en dicho cuerpo.

Tabla de Conductividades Térmicas y Propiedades de Metales[10]​.

Las unidades de las magnitudes están expresadas en el Sistema Internacional de Unidades de Medida.

Cálculo de resistencias térmicas

Para calcular la resistencia térmica es necesario transformar las ecuaciones que modelan los distintos mecanismos de transferencia de calor para que presenten la siguiente forma: (Ta - Tb) / Q-punto = expresión matemática = Rth.

La expresión de la resistencia térmica Rth es diferente en cada sistema y depende del mecanismo de transferencia.

En estos casos se debe distinguir entre las diferentes geometrías que se presentan en cada elemento resistivo; las configuraciones geométricas más usuales: pared plana, pared cilíndrica y pared esférica.

Intercambiadores de calor

Un intercambiador de calor es un dispositivo diseñado para transferir calor por un mecanismo mixto de convección entre la película de un líquido procesado (medio cultivo) y la pared de un sólido metálico, seguido de la conducción del calor transferido al área transversal del sólido metálico (tubo o placa) y nuevamente la transmisión de calor por convección desde la pared del sólido metálico a otro fluido procesado (agua).

Como se observa en las figuras existen diversas formas de diseñar un intercambiador de calor.

Arriba: un serpentín es un tubo metálico que se encarga del intercambio térmico; el líquido refrigerante recoge (absorbe) o transmite el calor.

Abajo: una camisa o chaqueta es un dispositivo cerrado de intercambio térmico; en tanto que, un regenerador de calor es un dispositivo abierto.

En todos los casos el mecanismo mixto de intercambio térmico es la convección que conduce el calor entre sólidos metálicos estáticos y superficies fluidas móviles.

Intercambiadores de Tubos:.

Como se observa en la figura existen dos configuraciones para la dirección del flujo fluido:.

a) Flujo paralelo: los dos fluidos entran por el mismo extremo y fluyen en el mismo sentido.

b) Contraflujo: los fluidos entran por los extremos opuestos y también fluyen en sentidos opuestos.

En un intercambiador de calor en flujo paralelo la temperatura de salida del fluido frío nunca puede ser superior a la temperatura de salida del fluido caliente.

En un intercambiador de calor en contraflujo la temperatura de salida del fluido frío puede ser superior a la temperatura de salida del fluido caliente.

El caso límite ocurre cuando la temperatura de salida del fluido frío es igual a la temperatura de entrada del fluido caliente. La temperatura de salida del fluido frío nunca puede ser superior a la temperatura de entrada del fluido caliente.

Como se observa en la figura en los intercambiadores de calor compactos los dos fluidos fluyen en direcciones ortogonales entre sí (90°) esta configuración de flujo recibe el nombre de flujo cruzado y se clasifica en función del mezclado:.

a) Flujo cruzado mezclado: uno de los fluidos fluye libremente en dirección ortogonal al otro sin restricciones;.

b) Flujo cruzado no mezclado: se disponen las placas para guiar el flujo de uno de los fluidos en dirección ortogonal al otro sin que se mezclen.

Como se observa en la figura los intercambiadores de casco y tubos se clasifican según:.

a) Número de pasos por el casco;.

b) Número de pasos por los tubos.

Un quimiostato es un sistema de cultivo en continuo; su operación esquemática es como la que muestra la figura.

Una operación en continuo exige una serie de consideraciones para modelar su comportamiento:.

Mezcla perfecta (sin gradientes de concentración y con agitación turbulenta);.

Flujo de entrada y salida iguales (F1 = F2 = F);.

Volumen de operación constante (volumen de líquido dentro del biorreactor: dV/dt = 0);.

Parámetros constantes de transferencia (temperatura, pH, velocidad de transferencia de oxígeno, etc.).

La operación industrial de un quimioestáto se ilustra en la figura.

Para iniciar un cultivo continuo; el biorreactor o el fermentado debe cargarse previamente con el inóculo del cultivo y luego de que este crece lo suficiente, alimentar el sistema con medio fresco a un caudal F1 y lavar el producto por un rebalse a un caudal F2, de modo que, el volumen se mantenga constante, el tiempo que dure el bioproceso o la fermentación. El caudal de salida F contiene células vivas (X), medio de cultivo con algún sustrato (S) parcialmente agotado (So) y posiblemente algún producto (P). Al alimentar con medio fresco (So) el caudal de entrada (F1), la biomasa (Xo) y el producto (Po) serán iguales a cero para las condiciones de entrada; por lo que, solo se deberá considerar la concentración de sustrato limitante del crecimiento (So) en la alimentación.

Balances y ecuaciones en el estado estacionario.

Teniendo en cuenta estas consideraciones, los balances de materia para X, S y P en el estado estacionario (E.E) serán:.

Balance de biomasa: VdX/dt = -FX + Vrx = –(F/V)X + µX = 0; rX = mX; E.E » dX/dt = 0. Por definición D = velocidad de dilución = F/V » µ = D.

Balance de sustrato: VdS/dt = F (So – S) – Vrs; rs = µX / YX/S; E.E » dS/dt = 0. Por definición: SEE = KsD / µm – D » XEE = YX/S (S0 – S).

Donde: D = velocidad de dilución; SEE = concentración del sustrato limitante de la velocidad en estado estacionario; XEE = concentración de biomasa en estado estacionario.

Balance de producto: VdP/dt = -FP + Vrp = PEE = qPX / D; rP = qPX; E.E » dP/dt = 0.

Donde: PEE = concentración del producto en el estado estacionario.

Nota: cuando el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento (S) es también la fuente de carbono: X = DY´X/S (So – SEE) / (D + msY´X/S).

Modelo cinético de Monod para el cultivo continuo

El modelo de crecimiento que se aplica en los sistemas de cultivo continuo es el modelo cinético de Monod: D = µmS / (KS + S) » S = KSD / (µm – D) » X = YX/S [S0 – KSD / (µm – D)].

Velocidad Crítica de Dilución: existe un valor de dilución por encima del cual es X = 0; es decir, se produce lavado o arrastre de la biomasa por encima del valor de equilibrio que permite el estado estacionario y F2 > F1.

Este factor se conoce como dilución crítica (Dc); Dc = µmSo / Ks + So.

En condiciones normales de operación continua S0 >> KS » DC = µm por lo que, un quimioestáto debe trabajar a una fracción de µm. En términos de crecimiento de la biomasa esto significa que el quimioestáto impone una condición selectiva al crecimiento del cultivo o el microorganismo.

Formación de producto: PEE = rp/D = qPXEE/D.

Determinación de Parámetros de Crecimiento: un cultivo continuo es sumamente útil para determinar parámetros de crecimiento.

1/D = 1/µm + Ks/µm * 1/SEE.

Se grafica 1/D en función de 1/S los puntos se ajustan a una recta cuya intersección con el eje 1/D es el valor de 1/µm y cuya pendiente es Ks /µm.

D (So – SEE) / XEE = D / Y´X/S + ms.

La gráfica de D (So-S) / X en función de D permite estimar 1/Y'x/s y µs cuando el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento es la fuente de carbono.

La ecuación de diseño nos da el tiempo de residencia (t) del cultivo dentro del biorreactor.

Para poder utilizar la ecuación de diseño hay que modificar la definición de componente X y sustituirlo por conversión X del componente i.

Por definición: Xi = Nio – Ni / Nio Donde: N = moles del componente i. Despejando: Ni = Nio (1 - Xi) » dNi/dt = -Nio dXi/dt = riV Con lo que, la ecuación de balance de biomasa para el estado estacionario se transforma en: -FXi + riV = VdXi/dt = 0.

Reordenado: V/F = ∆Xi / -ri = t = ecuación de diseño de un reactor de mezcla perfecta. Donde: t = tiempo de residencia del cultivo dentro del biorreactor; ∆Xi = Xi2 – Xi1 = dXi.

Otro término comúnmente utilizado en el diseño de reactores es el tiempo espacial (τ) el cual define el tiempo necesario para procesar o fermentar en el biorreactor, un volumen de alimentación, medido en condiciones de entrada (presión y temperatura), igual al volumen de operación del biorreactor (el que define el estado estacionario). El tiempo espacial se obtiene dividiendo el volumen de reactor (V) entre el caudal volumétrico de entrada al biorreactor (Q): τ = V/Q.

Observe que al igual que t las unidades de τ son s-1.

Un cultivo semicontinuo posee una línea de entrada o alimentación (F1). Para iniciar un cultivo alimentado (fed-batch) son válidas las mismas consideraciones que se hicieron para el cultivo continuo; pero, se inicia la alimentación del cultivo cuando el sustrato limitante de la velocidad se ha agotado; esto permite controlar la velocidad de crecimiento, regulando la velocidad de alimentación (caudal); finalmente se debe alimentar el cultivo con medio fresco.

Los balances de materia respectivos para X, S y P son:.

Nota: en estos casos el volumen V permanece dentro del operador diferencial; esto se debe a que varía con el tiempo.

Si en la ecuación de balance de sustrato la velocidad rs se reemplaza por rx / Yx/s se tiene: d (VS)/dt = FSo – 1/Yx/s. d (XV)/dt.

Para controlar la velocidad de crecimiento (rx) mediante el caudal de alimentación (F) el sustrato (S) debe ser cero en todo momento: S = 0 y por lo tanto: d (SV)/dt = 0. Esta condición equivale a que el sustrato sea consumido en su totalidad conforme ingresa al biorreactor; es por eso que se aplica la condición de alimentación fresca. Bajo estas condiciones, la ecuación de balance de biomasa se transforma en: d (VX)/dt = FSoYx/s y por integración: XV = XeVe + FSoYx/st Donde: Xe y Ve representan la concentración de biomasa y el volumen de cultivo al iniciar la alimentación.

La variación del volumen con el tiempo es: V = Ve + Ft.

El criterio para diseñar una alimentación adecuada se obtiene por la ecuación: FSo = VeµXe / Yx/s la ecuación es válida para cualquier rango de µ, hasta µm.

Como criterio adicional, sobre todo en procesos de fermentación se suele seleccionar un valor de So tan alto como sea posible y lo contrario con F (uno relativamente pequeño); a fin de evitar el lavado del cultivo por dilución excesiva. No obstante esto ocasionaría que la duración del cultivo (tiempo de fermentación) se prolongarse excesivamente. Para buscar el equilibrio se diseñó empíricamente una solución de compromiso: µ = 1 / VX. d (VX)/dt = Yx/sFSo / XeVe + Yx/sFSot.

Ecuación de diseño de un biorreactor semicontinuo ideal

Un sistema de cultivo semicontinuo es un sistema transciende; es decir, hay un flujo temporal o transitorio que alimenta o drena (lava) el sistema. El balance general de masa que se aplica a un volumen de control (diferencial de volumen) para un componente i en un sistema de flujo semicontinuo es:.

Entra - Sale - Desaparece = Acumula ―› Fi - (Fi+dFi) - (-rxi) dV = 0.

Operando se obtiene: - dFi = (-rxi) dV Por definición la conversión del componente i en reactores en flujo (semicontinuo) es: Xi = Fio – Fi / Fio por lo que, sustituyendo en la ecuación de balance: FiodXi = -rxidV Integrando la expresión anterior: ∫ dV/Fio = ∫ dXi/-rxi donde los límites de integración son: 0, V para el volumen y Xio, Xif para la conversión. Resolviendo la integral obtenemos: V/Fio = ∫ dXi/-rxi = t la ecuación de diseño para un biorreactor de flujo (semicontinuo). La ecuación es válida tanto si existe o no variación de caudal (flujo) del sistema. Cuando se requiere una expresión en función de la concentración, podemos utilizar la siguiente ecuación: Fio = CioQi donde Cio es la concentración del componente i en las condiciones de entrada y Qi es el caudal volumétrico del componente i. Sustituyendo: V/Fio = V/QiCio = τ/Cio donde τ es el tiempo espacial del biorreactor. En forma integral: τ = Cio ∫ dXi/-rxi

Para sistemas de densidad constante: τ = - ∫ dCi/-rxi.

Nota: al comparar la ecuación de diseño de un biorreactor semicontinuo ideal con la que se obtiene para uno discontinuo ideal, se observa que la diferencia está la expresión que toma el tiempo: t o t. En un biorreactor discontinuo, t representa el tiempo de cultivo tc y es igual a la duración del bioproceso o la fermentación; lo que equivale a decir, el tiempo necesario para que el sustrato limitante de la velocidad se agote. En un biorreactor semicontinuo (de flujo) el tiempo t corresponde al equivalente para que la conversión de salida alcance su máximo valor posible; es decir, para que la generación de biomasa o bien, del componente metabólico X, alcancen su máximo de crecimiento (µm) para un mismo componente i. Es por eso que en un biorreactor de flujo el tiempo t se llama también tiempo de residencia tr; ya que, es el tiempo que el cultivo reside dentro del biorreactor; el cual es diferente (mayor) del tiempo de cultivo tc, puesto que aún después de agotado el sustrato limitante de la velocidad, el cultivo (células o microorganismos) tiene la capacidad metabólica de seguir sintetizando metabolitos X o generar más biomasa (crecer); es por eso que le incorporan los adjetivos “limitante de la velocidad” al sustrato S.

Una sistema de cultivo discontinuo no posee alimentación (F1) o lavado (F2); se carga el contenido del biorreactor (tanda o lote) con el medio de cultivo y luego se inocula con el cultivo (células o microorganismos) y se deja crecer hasta obtener el producto (biomasa o metabolito).

Dado que F1 = F2 = 0, las ecuaciones de balance son:.

Generación de biomasa: cuando la operación discontinua tiene como objetivo la generación de biomasa (células o microorganismos); se parte del supuesto de que no se forma producto y que la relación µ-S puede ser representada por la ecuación de Monod, con lo que las ecuaciones de balance de biomasa y balance de sustrato limitante de la velocidad quedan:.

El sistema de ecuaciones posee solución analítica, pero en esta, no aparece X en forma explícita, por lo que, resulta de poca utilidad. Afortunadamente, es posible analizar casos particulares, haciendo algunas suposiciones. En el caso de tomar en cuenta únicamente la fase exponencial del crecimiento, cumple que: S » Ks y las ecuaciones se reducen a las originales, salvo que µ es substituida por µm:.

Dado que bajo tales condiciones el crecimiento ocurre al máximo valor de posible, integrando la ecuación de balance de biomasa con las condiciones: t = 0, X = Xo se obtiene una expresión para la concentración de biomasa en función del tiempo: X = Xo eˆµmt o bien: lnX = lnXo + µmt.

La ecuación establece que para S » Ks, el crecimiento es exponencial y permite calcular el valor de µm graficando el valor del logaritmo de X (ln X) en función del tiempo (t).

En forma similar, la concentración de sustrato limitante de la velocidad en función del tiempo es: S = So – [(Xo / Yx/s) (eˆµmt - 1)].

Conforme el sustrato se agota, S disminuye y la condición de S se hace comparable a Ks con lo que dX/dt comienza a disminuir (fase de desaceleración), hasta hacerse finalmente nula (S = 0); en este punto, se alcanza la máxima concentración de biomasa y finaliza el cultivo, pues se ha alcanzado la fase estacionaria.

La concentración final de biomasa (Xf) se puede calcular si se conoce Yx/s:.

Yx/s = - (Xf – Xo) / (Sf – So) Dado que Sf = 0, Xf = Xo + Yx/sSo

Lo usual es utilizar estas ecuaciones para calcular Yx/s.

En la figura se ilustran las distintas fases de crecimiento descriptas, que surgen de la ecuación de Monod. Note que antes de la fase exponencial existe una fase de retardo durante la cual, la concentración de biomasa no se modifica substancialmente pero, ocurren cambios en la composición macromolecular y en el "estado fisiológico" de las células del cultivo. Si por algún motivo debe tomarse en cuenta esta fase, se debe aplicar una corrección a la ecuación la concentración de biomasa en función del tiempo: lnX = lnXo + µm (t – tr) donde tr es el tiempo de retardo; es decir, la modificación consiste en restarle al tiempo real, el tiempo transcurrido hasta que comienza el crecimiento exponencial. Normalmente, la fase de retardo no es deseable, tanto por la pérdida económica como por el tiempo desperdiciado; para minimizarla se hace crecer el inóculo aparte, en un medio de cultivo igual al que se va a emplear en el bioproceso (cultivo o fermentación) y luego se procede a transferirlo cuando las células ya se encuentran en la fase exponencial. La última fase es la decaimiento o muerte y consiste en la disminución de la concentración celular de la biomasa por lisis o muerte celular.

Ecuación de diseño de un biorreactor discontinuo ideal

Un sistema de cultivo discontinuo es un sistema discreto en cuanto al movimiento de biomasa, ya que no hay flujos. Como condiciones de idealización en un biorreactor discontinuo ideal se supone que el cultivo y su medio están perfectamente agitados y que los parámetros de velocidad (r) son constantes en todo el volumen del sistema (volumen de control); es decir, que la mezcla es perfecta. La otra consideración es que se trabaja con velocidades y componentes individuales (i), por lo que se utiliza la definición de conversión del componente i (Xi), en vez de biomasa; es decir, se trabaja el componente metabólico, no la célula.

La ecuación de balance del componente i es: d (Xi)/dt = rxi = µXi.

Teniendo en cuenta la definición de conversión y diferenciando Ni respecto al tiempo: dNi/dt = -NiodXi/dt.

Sustituyendo en la ecuación de balance: -NiodXi/dt = rxiV.

Separando en variables e integrando: ∫ (Nio/-rxiV) dXi = ∫ dt donde los límites de integración son: Xio (conversión de entrada) y Xf (conversión final) para la conversión y to = 0 (tiempo inicial) y tf (tiempo total de reacción) para el tiempo de reacción.

Integrando obtenemos: t = Nio ∫ dXi/-rxiV la ecuación general de diseño para un biorreactor discontinuo ideal.

Un biorreactor con aireación es por definición un reactor continuo donde la entrada F1 es una línea de alimentación de aire estéril (O); la salida F2 es una línea de lavado de aire estéril y el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento es el oxígeno disuelto (OD).

Existen dos tipos o diseños básicos de biorreactores con aireación; ambos, de uso muy difundido: el primero es tanque agitado con línea de aireación y el segundo es el de levantamiento por aire o "air lift". De este último existe también, una variante que se utiliza para cultivos aeróbicos muy resistentes a esfuerzos cortantes e hidrodinámicos y es la cama de burbujas o “bubble bed”.

Estructura de un reactor continuo de tanque agitado con línea de aireación

Un CSTR con línea de aireación es utilizado, por lo general, como dispositivo fermentador para células y cultivos aeróbicos; su esquema se representa en la figura. En él, la aireación se da en régimen laminar o de transición (Re≤3000) por cuanto estas fermentaciones son destinadas a cultivos de células y microorganismos aeróbicos “sensibles” a esfuerzos cortantes e hidrodinámicos altos. La agitación “extra” requerida se realiza mecánicamente, por medio de: un eje transmisor de potencia provisto de aletas o turbinas de agitación y accionado por un motor de corriente alterna con control de potencia y velocidad.

Además de esto, es indispensable que el sello mecánico del eje del motor sea hermético y esterilizable; que las líneas de entrada y salida de aire sean estériles y que la difusión del aire dentro del biorreactor sea controlada en presión, flujo y concentración. Para completar el esquema de diseño: el aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es difundido a través de toda la mezcla por una corona con pequeños orificios espaciados regularmente o una boquilla de difusión. La “cama” de aire debe ser un “chorro” de finas burbujas de aire de pequeño diámetro, que salen de cada orificio de la corona o el difusor (boquilla) y al ser "golpeadas" por las paletas de la turbina o el agitador, se distribuyen por todo el volumen, generándose miles de pequeñas burbujas de aire que, difunden el O disuelto hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o seis deflectores o “baffles” que rompen el movimiento circular que imprimen las paletas de la turbina o el agitador al líquido y generan mayor turbulencia y mejor mezclado; pero sin dañar el tejido o la pared celular de las células y microorganismos (tamaño de Kolmogorov de los Eddies). Finalmente, el tanque debe poseer un intercambiador de calor formado por una camisa por la que circule agua, para poder controlar la temperatura del cultivo y evitar que este muera o sufra un estrés térmico.

Estructura de un biorreactor de levantamiento por aire

Cuando el volumen es muy grande (mayor que 1000 l) o se requiere de un mayor volumen de aireación, el sistema CSTR, ya no es eficiente y se requiere del levantamiento por aire. Debido a que, a mayor volumen de cultivo, también es mayor la cantidad de calor generado; se hace necesario, aumentar el área de transferencia de calor y la eficiencia de refrigeración; por lo que, el intercambiador de calor de camisa debe ser reemplazado por uno de serpentín en contra flujo o con circulación adyacente a la pared interior del tanque. Ver esquema representado en la figura.

Al igual que en el diseño de tanque agitado, el aire que ingresa al biorreactor debe ser estéril; esto se consigue, haciéndolo pasar por un filtro microporo de diámetro de poro inferior a los 0,45 micrones (0,2 µm – 0,1 µm) que impida el paso de microorganismos contaminantes. En los biorreactores de levantamiento por aire o "air lift" la cama de aire también funciona como medio de agitación; de modo que, se genere una circulación fluida de líquido con aire (burbujas) que asciende el compartimiento interno y luego desciende por el compartimiento externo, favoreciendo el mezclado perfecto.

Transferencia de O2 y balance de oxígeno

La velocidad de transferencia de 02 (r02) desde el seno de la fase gaseosa (burbujas) hasta la fase líquida (medio líquido) está determinada por la siguiente ecuación: rO = Kla (C*- C) donde KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno; C la concentración de 02 disuelto en el seno del líquido y C* la concentración de O disuelto en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase gaseosa. El KLa y por lo tanto el grado de transferencia de oxígeno desde el seno del líquido hasta las células o microorganismos en cultivo, dependen del diseño del biorreactor y de las condiciones de operación del sistema de cultivo: caudal de aire, volumen del líquido, régimen de agitación, área de transferencia y viscosidad del cultivo. En general, disminuyen el KLa: la viscosidad y el volumen del líquido y aumentan el KLa: el área de transferencia, la agitación y la presencia de dispositivos que aumenten una, la otra, o ambas.

La ecuación de balance de oxígeno en el estado estacionario es: d(VCO) / dt = F (C – C*) – VrO + VNiO donde Ni es la velocidad de transferencia de un componente del gas (oxígeno) al líquido (medio). Dado que el oxígeno es el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento, cuando el cultivo se encuentra en crecimiento, el flujo de entrada oxígeno (FiO) será mayor al flujo de salida de oxígeno (FfO) debido al consumo de oxígeno disuelto en el líquido por parte de las células o microorganismos en crecimiento y/o división celular.

En este caso, la ecuación de balance de oxígeno para células o microorganismos en crecimiento es: d(VCO) = FiOC – FfOC* – VrO + VNiO es decir, debe utilizarse la ecuación general.

Sistema de aireación

El sistema de aireación externamente comprende las líneas de entrada Fi y salida de aire Ff e internamente debe optimizar la transferencia de gases nutrientes (aire) hacia el medio líquido. Un sistema de aireación consta de cuatro partes mecánicas: fuente de aire; tubería y filtros de entrada; boquilla y difusor de aire; tubería y filtros de salida. Y tres partes de control: control de flujo aire; control de presión de aire; control de difusión de oxígeno disuelto.

Fuente de aire: dado que el sistema de aireación, en su conjunto, depende de la correcta elección del dispositivo que suministrará la fuente de aire, se siguieren dos opciones:.

a) El compresor de diafragma: está diseñado para un trabajo de operación continua; su presión operación es moderada ≈ 60 psia y como su nombre lo indica, utiliza un diafragma o fuelle para impulsar y comprimir el aire. El compresor de diafragma resulta adecuado para oxigenar volúmenes medianos de cultivos o microorganismos aeróbicos.

b) El compresor de pistón: es más utilizado comercialmente, no obstante, para cultivos celulares sensibles (células de membrana plasmática), no es recomendable, por cuanto, su presión de operación es muy alta (80 psia o más) para estos cultivos y puede causar daño celular severo o la lisis de las células; y porque, el pistón debe lubricarse con aceite y esto ocasiona que se filtre en pequeñas cantidades a la corriente de aire.

Tubería - Línea de aire: esta debe ser de acero inoxidable.

Filtros de las líneas de aire: para sistemas pequeños de diámetros de tubería estándar, se utilizan filtros en línea con la tubería; estos son de membrana microporo que filtran el 99,99% de los contaminantes. Para sistemas mayores (industriales) debe diseñarse un método de esterilizar in situ la línea de aire; generalmente se hace calentando fuertemente la línea de aire y luego enfriarla. Las membranas microporo que filtran el aire tienen un punto de burbuja que es la presión de agua máxima que pueden soportan antes de romperse (recuerde que el sistema tiene un medio líquido) y un flujo máximo el cual es el máximo caudal que puede soportar la membrana antes de su ruptura.

Sistema de difusión de oxígeno disuelto: debe optimizar al máximo la transferencia de oxígeno disuelto al medio líquido. El sistema consta de dos partes mecánicas: boquilla y difusor de aire; una parte de medición: sensor de oxígeno disuelto y una de control: controlador de oxígeno disuelto.

Difusor de aire: los cultivos aeróbicos requieren que la corriente de aire estéril que se difunda en la forma de miles de pequeñas burbujas, desde el difusor de aire, hacia el volumen del líquido; esta acción se realiza mediante un plato o domo cilíndrico de acero inoxidable finamente perforado. Alternativamente y si el sistema es pequeño o mediano en escala, se puede utilizar un difusor de material cerámico poroso el cual, tiene la ventaja de que, provee una cama más fina de burbujas (de menor diámetro) y mayor área de transferencia (volumen de burbujas).

Los cultivos anaeróbicos y facultativos están constituidos por células y microorganismos cuyo metabolismo ante la ausencia de oxígeno, utiliza vías metabólicas alternas para la oxidación de los compuestos que le sirven de nutrientes. En estas células y microorganismos, la respiración celular se sustituye por una ruta oxidativa alterna llamada fermentación en la que, el piruvato no produce CO como producto final de desecho; por el contrario, se consume CO y esta es incorporado, junto al piruvato, en la fermentación, cuyo producto final de desecho, le da nombre; por ejemplo: en la fermentación alcohólica el piruvato se oxida a acetaldehído y al final de la cadena oxidativa se produce etanol como producto final de desecho.

Un fermentador es un dispositivo de tipo tanque agitado en el que se realiza una fermentación controlada. Los fermentadores suelen operar en modo semicontinuo; por cuanto, debe alimentarse una línea de sustrato limitante de la velocidad de crecimiento (S) para mantener el crecimiento celular o microbial durante la fermentación.

El catabolismo celular de las fermentaciones además del producto final, produce gran cantidad de subproductos de desecho y metabolitos secundarios que son excretados al medio de cultivo, por las células en cultivo, y esto genera gran cantidad de espuma en el caldo de fermentación. Las espumas modifican la acidez del medio de cultivo ya que, cambian el pH del medio de cultivo y por tanto, debe regularse y controlarse la acidez del medio adecuadamente. Medir y controlar el pH es un aspecto muy importante de los bioprocesos, ya que los cambios en el pH pueden alterar significativamente las condiciones de crecimiento, generalmente con consecuencias importantes. Los medios de cultivo suelen incluir tampones, es decir, sustancias que mitigan los cambios de pH demasiado repentinos causados por la adición de un ácido o una base. Debido a que un goteo de ácido en el medio de cultivo puede dañar muchas líneas celulares, los científicos a menudo enriquecen cuidadosamente la mezcla de gas utilizada en el cultivo celular con CO2 en lugar de agregar un ácido líquido. Luego, el gas se disuelve en el medio de cultivo, lo que permite que el dióxido de carbono influya en el pH en combinación con un tampón.[8]​ Adicionalmente, la turbidez y la cantidad de espuma, deben mantenerse en niveles adecuados para evitar pérdidas y el mal funcionamiento del biorreactor.[9]​ Finalmente, la mayoría de los procesos fermentativos generan gran cantidad de calor debido a la naturaleza exergónica del catabolismo celular de estos microorganismos, por lo que, la temperatura también debe ser controlada.

En la mayoría de los cultivos anaeróbicos el dióxido de carbono (CO) es el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento por lo que, la cinética del sistema de cultivo debe modificarse incorporando la ecuación de balance de consumo de CO: d(VCCO)/dt = FiCCOi – FoCCOo + VrgCO – VNoCO

Donde: CCO = concentración de CO en el líquido; rg = velocidad de generación; No = velocidad de transferencia de un componente del líquido al gas; i = ingreso; o = salida.

Control y Medición del CO Disuelto (COD): la curva de generación de CO se debe determinar experimentalmente para determinar la velocidad de consumo de sustrato limitante de la velocidad (rgCO) del cultivo; para eso, es necesario mantener el crecimiento máximo del cultivo.

En la práctica la curva de consumo de CO se determina basándola en la concentración de dióxido de carbono disuelto (COD) en el medio de cultivo; esta puede ser medida y controlada con un dispositivo comercial diseñado para ese propósito, un controlador COD y la sonda o probeta COD respectiva.

El suministro de CO se obtiene con un cilindro de CO recargable.

La regulación del flujo de CO se realiza manualmente con un regulador manual de flujo o manómetro; se debe hacer de forma que, se mantenga la concentración máxima de dióxido de carbono disuelto, medida en el controlador COD, para que, la velocidad específica de consumo de sustrato para mantenimiento (m) se mantenga en todo momento.

El control de flujo de CO se realiza utilizando una válvula solenoide electrónica que el controlador COD dirige al recibir la señal de la probeta COD y sobre la base de su valor, comanda la apertura o clausura de una válvula solenoide, mediante una señal de paso (abrir o cerrar) que regula el flujo de CO proveniente del tanque de CO comprimido. Las válvulas solenoides son servo mecanismos eléctricamente controlados y se escogen de acuerdo al material, al número de vías, al calibre y la presión y si permanecen abiertas o cerradas, entre otros.

La difusión del CO en el medio líquido se realiza utilizando una boquilla de difusión o un difusor de gases de material cerámico poroso.

Sistema de Control de Espuma

La presencia de oxígeno en el ambiente interno del biorreactor ocasiona que los productos de desecho del catabolismo celular de los microorganismos facultativos, sean oxidados, por lo que, las espumas se tornan densas y “jabonosas” ocasionando serios problemas funcionales y contaminado el cultivo.

Un sistema de control de espuma (ver diagrama) consta de dos subsistemas sistemas que funcionan en conjunto:.

El frasco dispensador es factor común en ambos subsistemas.

La bomba peristáltica “maja” la manguera flexible e impulsa el flujo del fluido antiespumante dentro del biorreactor.

La manguera flexible se escoge según el material, el tipo de bomba y la longitud; se recomienda una de silicón curado o Tygon y para un sistema de bombeo L/S (bomba sencilla de velocidad fija o variable).

Nota: la manguera flexible se conecta al sistema (biorreactor) mediante un tubo de adición de reactivo.

Este debe ser de acero inoxidable y su diámetro (puerto) debe ser el diámetro interno de la manguera flexible.

El sistema controla el pH del medio de cultivo; que es generada por los productos de desecho y el metabolismo propio del cultivo celular o microorganismos. Un sistema de control de acidez consta de:.

Dos subsistemas mecánicos servo controlados.

Nota: recuerde que las mangueras flexibles se deben conectar al sistema (biorreactor) mediante un tubo de adición de reactivo para cada una de ellas.

Un sistema de control formado por:.

Un sistema de medición: formado por:.

Al crecer los microorganismos en ambientes naturales, su rango de pH se acerca a los valores del hábitat en que se desarrolla; el rango normal de acidez en que pueden sobrevivir la mayoría de los microorganismos es 2,0 ≥ pH ≤ 10,0.

La mayoría de los hábitats tienen valores de pH de 5,9 por lo que, los microorganismos que viven en esos hábitats tienen un pH óptimo equivalente (5,9).

Algunos rangos de pH óptimo son: para levaduras entre 3,5 y 5,5; para bacterias entre 6,0 y 7,5; para mohos, según la cepa, se extiende entre 3 y 7; para células en cultivo entre 6,0 y 7,5.

La forma exacta de la curva de acidez es muy variada y depende del metabolismo propio de cada microorganismo o célula por lo que, no se ha formulado un modelo general y simple para representarla.

Sistema de control de temperatura

Mantiene estable y dentro de un rango óptimo requerido por el cultivo para su máximo crecimiento, la temperatura interna del sistema.

Un sistema de control de temperatura consta de:.

Dos sistemas de intercambio térmico:.

Un sistema de control:.

Un sistema de medición:.

Un servo control:.

Un sistema regulador de paso de flujo:.

Un sistema de conducción de fluido:.

Nota: las tuberías deben anclarse al cuerpo del biorreactor mediante un puerto de entrada que es soporte hermético que la sujeta a la superficie plana.

Temperatura Óptima: la temperatura es otro factor ambiental que influye y que afecta el crecimiento del cultivo microbiano y celular; poniendo el juego, la propia supervivencia de la célula o microorganismo. La temperatura afecta a las células y microorganismos cultivados de dos formas distintas:.

En este punto analizaremos únicamente el primer ítem; más adelante veremos el segundo.

Para cada célula y microorganismo existe una temperatura mínima por debajo de la cual, no hay crecimiento; es decir se inhibe el crecimiento celular.

Y una temperatura máxima por encima de la cual, la célula o microorganismo muere.

Entre ese rango de temperaturas existe una temperatura óptima para la cual, el crecimiento es el más rápido posible.

Estas tres temperaturas son características de cada célula y microorganismo y pueden variar ligeramente con la composición del medio de cultivo.

Determinación de la Temperatura Óptima de Crecimiento: se realiza desde el punto de vista cinético, aplicando la Ley de Arrhenius para el crecimiento y la muerte de células o microorganismos: dln (k)/dt = Ea/RT2; dln (k) = -(Ea/R)*d(1/T) Donde: k = máx (para el crecimiento), k = máx (para la muerte), T = temperatura absoluta, R = Constante de los gases ideales, Ea = energía de activación del proceso: EC para el crecimiento, Em para la muerte; EC = 8 – 12.000 cal/g-mol K (crecimiento), Em = 50 – 100.000 cal/g-mol K (muerte).

La realización de la curva de crecimiento EC en conjunto a la curva de muerte Em representada por su logaritmo ln (k) versus el inverso del tiempo 1/T conduce a la determinación gráfica de la temperatura óptima.

Componentes de diseño de un biorreactor de tanque agitado

Para lograr el cumplimiento de objetivos descritos, un biorreactor de tipo tanque agitado o CSTR (ver figura), debe contar con los siguientes componentes básicos en su diseño:

figura.

Un sistema de agitación consta de cuatro partes mecánicas:.

Motor Impulsor: suministra la potencia al eje de potencia; debe ser de corriente alterna (a.c), preferiblemente de inducción y su potencia debe calcularse para manejar el doble (200%) de la potencia teórica requerida para agitar el fluido y el cultivo a Re≥3000. Motor de Inducción (A.C): dado que un biorreactor debe operar de forma continua durante todo el proceso de cultivo; se requiere un motor capaz de resistir largos periodos de operación continua y trabajo duro; por eso, el motor debe ser de inducción de corriente alterna (a.c) y debe ser acorazado, preferiblemente en acero inoxidable.

Eje trasmisor de la potencia: es una barra cilíndrica de acero inoxidable 316L y por lo general se diseña en diámetros estándar: ¾”, ½”, etc., para mayor facilidad de ajuste a los estándares de motores a.c. Su longitud depende de la profundidad del contenedor (tanque).

Acople del Eje Transmisor: ajusta y fija al motor, el eje transmisor de potencia. Existen dos tipos de acople:.

Acople-adaptador de tipo taladro: el puerto de entrada se acopla al eje del motor por fijación directa. El puerto de salida es un dispositivo que se adapta a varios diámetros de broca y sujeta o abraza firmemente el eje transmisor de potencia por presión y abrasión; similar al que utilizan los taladros mecánicos.

Acople-ajustador de tipo tornillo-rosca: el puerto de entrada se “enrosca” o se fija firmemente al eje del motor. El puerto de salida es un dispositivo que “abraza” el eje transmisor de potencia por un mecanismo de tornillo-rosca.

En ambos casos, el diámetro del puerto de entrada del acople que es la unión de este con el eje del motor debe ser de diámetro interno igual al diámetro externo del eje del motor y el diámetro del puerto de salida que es dispositivo sujetador del eje transmisor de potencia debe ser el mismo que el diámetro externo del respectivo eje.

Puerto de Entrada del Biorreactor: se denomina puerto a la superficie física sobre el cual se instala un dispositivo de entrada o salida al biorreactor, un anclaje o un aparato mecánico o de medición; el puerto es el medio por el cual, se ajusta o fija, tal dispositivo o artefacto a la pared o superficie del tanque o del biorreactor. Como se observa en la fotografía, el puerto de entrada es la tapa o cara superior del tanque biorreactor y en donde se anclan o sujetan todos los dispositivos y periféricos que se requieren para su operación. Cada dispositivo de anclaje o sujetador también un puerto menor cuyo diámetro externo es la superficie externa total y cuyo diámetro interno es el diámetro externo del dispositivo que sujeta. Algunos puertos tienen dos diámetros internos, cuando el dispositivo que sujetan tiene diámetro externo y diámetro interno; por ejemplo, los sensores o probetas medidores y el sello mecánico del eje del agitador.

Sello Mecánico: su función es triple: evitar la contaminación, mantener hermético el sistema, servir de amortiguador de fricción. El sello mecánico también debe permitir la esterilización in situ del biorreactor, mediante una línea de vapor sobrecalentado. Un sello mecánico, generalmente se diseña en una de dos configuraciones:.

Cartucho rígido: que permite el rodamiento del eje de potencia a través de soporte de cuerpo rígido que sella y aísla el paso de cualquier materia al interior del depósito.

Cartucho flexible: que permite el rodamiento del eje de potencia a través de un soporte fijo al exterior pero flexible en el interior y que también sella y aísla el paso de contaminantes al interior del depósito.

En ambos caso el sello mecánico se especifica de acuerdo al diámetro eterno del eje transmisor de potencia; el cual es el diámetro interno del puerto del sello mecánico. Dentro de lo posible se recomienda el uso de sellos flexibles ya que amortiguan mejor las vibraciones mecánicas del eje transmisor de potencia; la desventaja es que esa flexibilidad obliga a cambiarlos más frecuente, pues el desgaste es mayor.

Eje Transmisor de Potencia: transmite la potencia del motor al impulsor, a través de, las hojas de agitación. Existen ejes en los cuales ya vienen incorporadas hojas o aspas de agitación, se diseñan para operar en uno de dos sistemas de flujo, según sea, la orientación espacial de las hojas o aletas:.

Flujo axial: suministran mayor efectividad de mezclado (distribución) y reducen la potencia de mezclado requerida, al distribuir mejor la mezcla; sus hojas u aspas son planas.

Flujo radial: generan mayor potencia de mezclado (turbulencia) y pueden causar daño celular; sus hojas o aspas son del tipo hélice.

Impulsores: son los dispositivos que impulsan el fluido y el movimiento, mediante hojas o aspas unidas al eje transmisor de potencia; pueden ser del tipo mecánico (agitador) o hidráulico (turbina).

Agitadores: es un impulsor formado por hojas o aspas de agitación conectadas al eje transmisor de potencia; pueden tener una distribución de flujo axial o radial.

Los propulsores de flujo radial pueden tener gran variedad de formas y diseños; dentro de estos, las hélices son las que más se utilizan.

Hélices: existen en tres diseños básicos que dependen de la orientación espacial:.

(a) – Plano XY,.

(b) – Plano ZX,.

(c) – Plano ZY.

Cada orientación (plano) describe una superficie curva que es determinada por dos (2) de tres (3) ángulos de diseño:.

(a) Plano XY, determina el ángulo de inclinación (α), este varía 15’ ≤ α ≤ 45’;.

(b) Plano ZX, determina el ángulo de torsión (β), este varía 16’ ≤ β ≤ 32’;.

(c) Plano ZY, determina el ángulo de tensión (γ), este varía 15’ ≤ γ ≤ 45’.

Como se observa en la figura:.

(a) – Hélices de superficie curva en el Plano XY están determinadas por los ángulos α, β;.

(b) – Hélices de superficie curva en el Plano ZX están determinadas por los ángulos α, γ;.

(c) – Hélices de superficie curva en el Plano ZY están determinadas por los ángulos γ, β.

Por su gran potencia y la turbulencia que generan, las hélices no se recomiendan para cultivos de células sensibles; solo deben utilizarse para cultivos bacteriales o micóticos y a bajas velocidades de rotación.

Turbinas: es un impulsor de flujo axial el cual opera como una centrífuga que distribuye el flujo de líquido a través de hojas planas, a todo el volumen de fluido.

El impulso axial ha demostrado ser la forma más eficiente de diseño para reducir esfuerzos cortantes e hidrodinámicos y disminuir la turbulencia y la potencia requerida para homogeneizar el mezclado; objetivo que se persigue en una mezcla perfecta. Por eso se recomienda impulsores de flujo axial para cultivar células sensibles o de membrana plasmática. Dentro de estas, la turbina Rushton (b) es el impulsor de flujo axial más recomendado y más eficiente para generar una mezcla perfecta de alto perfil hidrodinámico, bajo en esfuerzos cortantes y alto en distribución.

Y una de control:.

Control de Velocidad del Motor: los motores de inducción de corriente alterna (a.c) tienen velocidades nominales de rotación de 1800rpm o 3600rpm. Estas velocidades son muy altas para los sistemas biológicos causando la destrucción de las células y microorganismos en cultivo. La velocidad de rotación del motor debe entonces reducirse a un máximo de 600rpm (revoluciones por minuto) para que no cause daño celular. Usualmente se acopla a la salida de eje del rotor una caja de reducción de 1/3 o 1/6 para bajar la velocidad de rotación a 600rpm. Adicionalmente se coloca un control de velocidad que puede ser analógico o digital al motor para un control más fino y preciso de la velocidad de rotación.

Agitación y Mezclado.

Relaciones de Potencia y Mezclado: conforme el diámetro de la hoja o aspa (Dd) aumenta, también lo hace, la potencia (Pt) requerida para realizar el trabajo de mezclado; la potencia de mezclado (Pm) es mayor porque el torque (τ) se acrecienta, recuerde que el torque es la relación entre la fuerza (F) y el brazo de palanca (r) y que, el brazo de palanca es el diámetro del aspa u hoja cuyo momentum (mv) aumenta al aumentar la velocidad de rotación (ω). Así entonces, cuando Dd es muy grande, debe disminuirse ω para reducir Pt; pero esto ocasiona que Pm también se contraiga; así como la turbulencia excesiva. Caso contrario ocurre cuando Dd es muy pequeño, debe aumentarse ω para mejorar Pm y extender la turbulencia, ya que, en estos casos, es localizada (se acumula alrededor de las aspas y hojas). Este fenómeno local que se conoce como potencia fluida (Pf) provoca que el volumen de líquido que es afectado por la turbulencia local (Rex) no sea suficiente para oxigenar los tejidos y células en cultivo pues el Kla disminuye. Para que la Pf se transmita a todo el volumen de operación del fluido, es necesario que, se alcance el estado estacionario (EE) en dicha operación, y esto toma mucho tiempo lo que implica, un alto costo.

La mejor forma de combinar positivamente estos efectos hidrodinámicos que se contraponen; es decir: bajar Pm y aumentar Pf es optimizar Dd. A esto se le conoce como potencia óptima de mezclado (Pe) y se logra de dos maneras:.

La primera alternativa minimiza la potencia de mezclado requerida y maximiza la potencia fluida al aprovechar mejor el gradiente de mezcla. La segunda aumenta la potencia de mezclado y la potencia fluida pero también, la potencia requerida y desaprovecha el gradiente de mezcla y difusión.

Utilización de Bafles: son una mejora muy utilizada ya que pueden instalarse fácilmente en los sistemas de agitación, disminuyen (deflectan) la turbulencia ocasionada por las hojas o aspas del impulsor, rompen (disgregan) los cúmulos celulares y micelios que se forman en los respectivos cultivos y mejoran la eficiencia de mezclado. La relación óptima del diámetro del bafle (Db o J) al diámetro de tanque (Dt) es: Db/Dt = 1/10–1/12. El número indicado de bafles es 4 para sistemas moderadamente agitados y 6 para sistemas turbulentos.

Sistemas de intercambio térmico

La transferencia de calor es un proceso el que se intercambia energía en forma de calor entre distintos cuerpos o entre diferentes partes de un mismo cuerpo que están a distinta temperatura. El calor se transfiere por una combinación de dos o más de estos tres procesos: convección, conducción o radiación. Uno de los mecanismos térmicos (proceso) suele predominar sobre los otros dos, también es posible que los tres procesos se den simultáneamente. La conducción es el proceso dominante en los intercambiadores de calor de casco y tubos y en el tubo serpentín. Aunque el mecanismo exacto de la conducción no se comprende, se sabe que se debe al movimiento (energía cinética) de los electrones libres que se mueven por la red cristalina del sólido y transportan energía cuando existe una diferencia (gradiente) de temperatura.

Ley de Fourier: J = KδT/δx Donde J = densidad de corriente de energía (J/m²s); K = conductividad térmica (constante característica del material).

La velocidad de conducción de calor (J) a través de un cuerpo sólido (medida por unidad de sección transversal) es proporcional directamente al negativo del gradiente de temperatura que existe en dicho cuerpo.

Tabla de Conductividades Térmicas y Propiedades de Metales[10]​.

Las unidades de las magnitudes están expresadas en el Sistema Internacional de Unidades de Medida.

Cálculo de resistencias térmicas

Para calcular la resistencia térmica es necesario transformar las ecuaciones que modelan los distintos mecanismos de transferencia de calor para que presenten la siguiente forma: (Ta - Tb) / Q-punto = expresión matemática = Rth.

La expresión de la resistencia térmica Rth es diferente en cada sistema y depende del mecanismo de transferencia.

En estos casos se debe distinguir entre las diferentes geometrías que se presentan en cada elemento resistivo; las configuraciones geométricas más usuales: pared plana, pared cilíndrica y pared esférica.

Intercambiadores de calor

Un intercambiador de calor es un dispositivo diseñado para transferir calor por un mecanismo mixto de convección entre la película de un líquido procesado (medio cultivo) y la pared de un sólido metálico, seguido de la conducción del calor transferido al área transversal del sólido metálico (tubo o placa) y nuevamente la transmisión de calor por convección desde la pared del sólido metálico a otro fluido procesado (agua).

Como se observa en las figuras existen diversas formas de diseñar un intercambiador de calor.

Arriba: un serpentín es un tubo metálico que se encarga del intercambio térmico; el líquido refrigerante recoge (absorbe) o transmite el calor.

Abajo: una camisa o chaqueta es un dispositivo cerrado de intercambio térmico; en tanto que, un regenerador de calor es un dispositivo abierto.

En todos los casos el mecanismo mixto de intercambio térmico es la convección que conduce el calor entre sólidos metálicos estáticos y superficies fluidas móviles.

Intercambiadores de Tubos:.

Como se observa en la figura existen dos configuraciones para la dirección del flujo fluido:.

a) Flujo paralelo: los dos fluidos entran por el mismo extremo y fluyen en el mismo sentido.

b) Contraflujo: los fluidos entran por los extremos opuestos y también fluyen en sentidos opuestos.

En un intercambiador de calor en flujo paralelo la temperatura de salida del fluido frío nunca puede ser superior a la temperatura de salida del fluido caliente.

En un intercambiador de calor en contraflujo la temperatura de salida del fluido frío puede ser superior a la temperatura de salida del fluido caliente.

El caso límite ocurre cuando la temperatura de salida del fluido frío es igual a la temperatura de entrada del fluido caliente. La temperatura de salida del fluido frío nunca puede ser superior a la temperatura de entrada del fluido caliente.

Como se observa en la figura en los intercambiadores de calor compactos los dos fluidos fluyen en direcciones ortogonales entre sí (90°) esta configuración de flujo recibe el nombre de flujo cruzado y se clasifica en función del mezclado:.

a) Flujo cruzado mezclado: uno de los fluidos fluye libremente en dirección ortogonal al otro sin restricciones;.

b) Flujo cruzado no mezclado: se disponen las placas para guiar el flujo de uno de los fluidos en dirección ortogonal al otro sin que se mezclen.

Como se observa en la figura los intercambiadores de casco y tubos se clasifican según:.

a) Número de pasos por el casco;.

b) Número de pasos por los tubos.